史琛榆，趙淳樸，胡藝瀟，沙桃平，王亞軍，王丹麗，徐善良*

(1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211; 2.寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

銀鯧(Pampusargenteus)，屬鱸形目(Pereiformes)，鯧科(Stromateidae)，鯧屬(Pampus)，主要分布于我國黃海南部和東海北部，為暖水性中上層集群性魚類，有結(jié)群和洄游習性。

近年來，由于全球氣候變暖，以及極端高溫、嚴寒天氣出現(xiàn)的頻率和強度增加，浙江沿海夏季表層海水溫度上升明顯，內(nèi)灣甚至最高可達到33 ℃以上，靜水池塘水溫更是能夠達到35 ℃的高水溫。一般研究認為，銀鯧生長最適水溫為22～26 ℃，當其長期處于30 ℃及以上水溫時，在高溫脅迫下會出現(xiàn)顯著的熱應激反應，如生長停滯、免疫力下降、感染疾病，從而導致機體內(nèi)酶系統(tǒng)癱瘓且代謝途徑受阻，最終爆發(fā)性死亡。

近年有關銀鯧的研究多集中在其分布與分類[1-2]、資源評估[3-4]、營養(yǎng)成分分析[5]、繁殖特性與生理[6-7]、人工繁殖與營養(yǎng)需求[8-9]等諸多方面。但有關銀鯧應對高溫脅迫的響應機制的研究尚未見報道。在養(yǎng)殖實踐中，每年7—8月銀鯧都會面臨極端的高溫脅迫，因而必須增開制冷機降溫，但耗能與養(yǎng)殖成本的增加又是不容忽視的問題。因此解開銀鯧面臨高溫脅迫的生理及其體內(nèi)相關基因的應答機制，有利于找到銀鯧內(nèi)在的不可逆臨界高溫值，從而指導并實際應用于銀鯧產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。

目前，有關高溫對海洋生物影響的研究主要通過急性熱刺激比較酶活性或熱休克蛋白家族基因表達的變化。徐冬冬等(2010)在高溫脅迫對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)生長及肝臟抗氧化酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)二者的活性隨著脅迫溫度的升高呈負相關[10]。田照輝等(2012)通過實時熒光定量技術發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)各組織中，hsp70基因在脾臟的表達量最高，鰓次之，肝最低(p<0.05)[11]。李林春等(2012)通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在高溫脅迫下抑制基因表達從而影響DNA復制、神經(jīng)系統(tǒng)過程和類固醇激素生物合成等生命活動[12]。但是多數(shù)研究并沒有結(jié)合生命活動的綜合調(diào)控機制，對不同溫度水平下海洋魚類的高溫應激能力做探討。綜上所述，本研究擬從組織學、酶活性及基因表達等多個方面，研究銀鯧在高溫脅迫下的生理和基因應答機制，初步闡明高溫對銀鯧生理機能及其相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用銀鯧為人工培育獲得，選取大小規(guī)格相近、健康的銀鯧作為實驗對象, 平均體重為105.31±6.76 g，平均體長15.33±0.95 cm。水溫用冷熱水機(廣東日生CW-2500A)進行調(diào)控。實驗期間海水鹽度為24～26，DO含量>7 mg/L，pH為8.1～8.2。

1.2 實驗設計和取樣

實驗設置4個溫度組: 對照組A(26 ℃)、B組(28 ℃)、C組(30 ℃)、D組(32 ℃)，每組設3個重復。每個重復均養(yǎng)殖于PP圓形實驗桶(1 t)內(nèi)，每桶12尾。將各組銀鯧成魚在26 ℃下暫養(yǎng)適應4 d，3個實驗組(B、C、D)按照設定溫度分別在24 h內(nèi)升溫至28、30、32 ℃。

在實驗開始后的第0、0.5、1、3、7天這5個時間點分別進行取樣，每次從每桶中取2尾，為避免取樣驚擾，先在同溫水中適應2 h，在取樣前經(jīng)MS-222麻醉后，稱體質(zhì)量(精確至0.01 g)，然后將魚體置于冰盤上解剖取樣，包括肝、腎、鰓，用生理鹽水沖洗。組織樣品切取5 mm大小用波恩氏液固定，分子樣品置于RNA保存液中，然后與營養(yǎng)分析的樣品一起置于-80 ℃保存。

1.3 組織的石蠟切片

用于切片的肝、鰓、腎組織，在波恩氏液中固定24 h后置于70%乙醇保存，后經(jīng)逐級脫水、透明、透蠟后，用石蠟包埋。將包埋后的組織切片(厚度5 μm)、展片、晾干后，HE染色，最后用中性樹膠封片。晾干后的切片在顯微鏡下觀察并對典型的結(jié)構(gòu)拍照。

1.4 組織氧化應激生化指標測定

將銀鯧肝組織按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶9加入9倍的1×PBS于勻漿器中充分勻漿，將10%的組織勻漿液于冷凍離心機4 ℃、4 000 r/min 離心10 min。取上清液，采用 Bicinchoninic acid (BCA)法測定組織中的蛋白質(zhì)濃度。對三種常規(guī)的組織氧化應激生化指標進行測定：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及丙二醛。實驗用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體實驗方法參見說明書。。

1.5 引物的設計

通過銀鯧轉(zhuǎn)錄組獲得銀鯧hsp70家族基因序列，用Primer Premier 5.0設計特異性引物，PCR獲得基因核心片段。根據(jù)獲得的銀鯧hsp70基因的核心片段設計實時定量PCR引物，基于銀鯧內(nèi)參基因18S cDNA序列設計內(nèi)參基因序列引物18S-F/R，引物序列見表1。

表1 hsp70基因引物Tab. 1 Primers used for hsp70

1.6 總RNA提取和hsp70基因核心片段克隆

本研究采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒進行RNA提取，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證所提取的RNA的完整性。對提取獲得的銀鯧肝臟組織總RNA通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。選擇銀鯧肝臟組織cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認目的條帶大小后，送華大基因公司測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast對比分析正確后獲得目的基因的核心片段序列。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

以18S cDNA為內(nèi)參基因，進行預實驗確定最佳稀釋濃度：樣品cDNA做3個10倍梯度稀釋，各設3個平行，進行RT-qPCR，而后建立標準曲線，確定最佳實驗稀釋的倍數(shù)為100倍。PCR反應體系(共20 μL)：SYBR Premix ExTaq 10 μL，ddH2O 7.2 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，對應退火溫度30 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。熒光定量數(shù)據(jù)分析采用△△Ct方法，使用2-△△Ct值表示目的基因的相對表達量。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計，采用One-way ANOVA 法進行顯著性檢驗，并用Duncan法檢驗法進行多重比較，實驗結(jié)果表示為平均值±標準誤差(M±SD)，p<0.05的實驗結(jié)果為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀鯧不同組織的組織學變化

與26 ℃對照組相比，不同高溫組短期脅迫后的銀鯧肝、腎、鰓組織均出現(xiàn)了不同程度的改變(圖1)。在26 ℃下，肝、腎和鰓組織結(jié)構(gòu)清晰。28 ℃時，銀鯧的肝臟淤血，肝臟組織結(jié)構(gòu)仍較清晰；鰓組織出現(xiàn)輕微的上皮位移現(xiàn)象；腎組織受溫度脅迫的影響不明顯，腎小管及腎小球的結(jié)構(gòu)并沒有出現(xiàn)明顯的變化。

圖1 不同溫度下銀鯧肝、腎和鰓組織顯微結(jié)構(gòu)變化Fig. 1 Microstructure changes in the tissues of liver, kidney and gill of Pampus argenteus at different temperatures(a)至(d)為26、28、30、32 ℃下銀鯧肝組織(×400)，(e)至(h)為26、28、30、32 ℃下銀鯧鰓組織(×400)，(i)至(l)為26、28、30、32 ℃下銀鯧腎組織(×200)。 Cv為中央靜脈，HCC為肝細胞索，1為淤血，2為脂質(zhì)空泡，3為細胞壞死產(chǎn)生的空洞，Cc為泌氯細胞，Pl為鰓絲，Sl為鰓小片，4為上皮位移，5為鰓絲末端充血和卷曲，6為動脈栓塞或充血，MMC為黑色素-巨噬細胞中心，RT為腎小管，G為腎小球，7為腎小管上皮位移，8為腎小球萎縮。

30 ℃時，銀鯧的肝細胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，存在脂質(zhì)空泡，且中央靜脈出現(xiàn)明顯的損傷；腎組織中的腎小管出現(xiàn)明顯的上皮位移的現(xiàn)象；此時可以觀察到鰓組織上皮位移的現(xiàn)象，鰓絲動脈栓塞或充血，鰓絲末端也出現(xiàn)充血和卷曲的現(xiàn)象。

32 ℃時，銀鯧肝臟原有結(jié)構(gòu)基本遭到破壞，可以觀察到脂質(zhì)空泡以及肝細胞壞死產(chǎn)生的空洞，肝細胞出現(xiàn)廣泛變性壞死；在鰓組織中可觀察到更明顯的上皮位移現(xiàn)象，且出現(xiàn)了大量的細胞破碎和壞死現(xiàn)象。腎組織中可以觀察到腎小球萎縮，腎小管出現(xiàn)上皮位移的現(xiàn)象嚴重，且部分腎小管的結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)細胞壞死的現(xiàn)象。

2.2 銀鯧肝組織中氧化應激生化指標變化

2.2.1 超氧化物歧化酶 高溫脅迫下，銀鯧肝臟SOD的活性變化見圖2(a)。各溫度組的SOD相對活性均于第0.5天顯著升高(p<0.05)，之后隨脅迫時間的增長，28 ℃組的SOD活性先下降后升高，最后在第7天下降至正常水平，變化過程類似“M”型趨勢；30 ℃組SOD的升高持續(xù)至第1天后開始下降，在第7天又顯著升高，變化過程類似于“N”型趨勢，且SOD相對活性在脅迫發(fā)生后的各時間點均顯著高于其他兩個溫度組(p<0.05)；32 ℃組SOD活性于1 d后顯著下降，至第7天顯著低于正常水平(p<0.05)。

2.2.2 過氧化氫酶 在不同溫度下，銀鯧肝臟CAT的活性變化見圖2(b)。28 ℃組的CAT活性在各時間點之間均無顯著性差異(p>0.05)。30 ℃和32 ℃組肝臟中的CAT活性均呈先上升后下降的趨勢，30 ℃組于0.5天時達到最大值20.96 U/mg prot，32 ℃組于第1天達到最大值21.95 U/mg prot，在第7天，30 ℃和32 ℃組CAT顯著低于正常水平(p<0.05)。

2.2.3 丙二醛 在不同溫度下，銀鯧肝臟MDA含量的變化見圖2(c)。肝臟中的MDA含量在28、30、32 ℃時變化趨勢基本一致，均在0.5天時顯著上升，后于第3天顯著下降，且均于第1天達到最大值。在第7天，30 ℃和32 ℃組MDA含量顯著低于正常水平(p<0.05)。

圖2 高溫脅迫對銀鯧肝臟中SOD活性、CAT活性和MDA含量的影響Fig. 2 Effect of high temperature stress on the hepatic SOD and CAT activities and MDA content of Pampus argenteus(a)為高溫脅迫對SOD活性的影響；(b)為高溫脅迫對CAT活性的影響；(c)為高溫脅迫對MDA含量的影響。不同小寫字母表示不同溫度組在同一時間點差異顯著(p<0.05)；不同大寫字母表示同一溫度組在不同時間點差異顯著(p<0.05)。

2.3 銀鯧hsp70基因核心片段的克隆及相對表達量的變化

對不同溫度下各時間點，銀鯧肝組織中hsp70基因的表達情況進行比較分析。結(jié)果顯示(圖3)，各溫度組hsp70基因的表達量變化趨勢均呈顯著上升后下降的趨勢。各溫度組在0.5天時顯著升高并達到峰值，之后迅速回落，且32 ℃組銀鯧的hsp70基因表達量顯著高于其他兩個溫度組(p<0.05)。與各組起始水平相比，0.5天時，32 ℃組hsp70基因表達量升高約260倍，30 ℃組為104.6倍，28 ℃組為36.4倍。

圖3 不同溫度下銀鯧肝臟hsp70基因的mRNA表達差異Fig. 3 Expression leves of hepatic hsp70 mRNAof Pampus argenteus at different temperatures

2.4 討論

2.4.1 高溫脅迫對銀鯧肝、鰓、腎三組織造成的損傷 研究表明，28、30、32 ℃高溫脅迫對銀鯧成魚的鰓、腎、肝組織的組織結(jié)構(gòu)均造成了不同程度的損傷。柳意樊等(2014)研究發(fā)現(xiàn)褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)不同組織對高溫的響應程度不同[13]；Rojas等(2013)對大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)在高溫脅迫下各組織的變化研究后提出鰓和肝組織是研究熱脅迫對組織影響的理想組織[14]，這與我們的研究結(jié)果一致。銀鯧肝、鰓組織結(jié)構(gòu)對高溫的響應程度大于腎組織，且產(chǎn)生的組織結(jié)構(gòu)改變更為明顯和復雜。此外，在28 ℃下，銀鯧魚各組織的結(jié)構(gòu)雖然產(chǎn)生了變化，但癥狀均表現(xiàn)為較輕微的上皮位移等。這表明28 ℃短時間的高溫脅迫對銀鯧魚的組織器官并不會造成較嚴重的影響，這也與實際養(yǎng)殖過程中的情況相吻合，28 ℃水溫下銀鯧只表現(xiàn)為攝食率有所下降，并不影響成活率。

2.4.2 銀鯧肝組織中抗氧化酶系統(tǒng)對高溫脅迫的響應 諸多研究表明，高溫脅迫對魚類抗氧化酶系統(tǒng)活性有顯著的影響。SOD和CAT是存在于生物體內(nèi)的非常重要的抗氧化防御性功能酶[15]，SOD可將代謝或外界刺激產(chǎn)生的有毒物質(zhì)氧自由基分解成過氧化氫,再通過 CAT將過氧化氫還原成氧分子和水，進而維持機體的正常生理活動。MDA 是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，主要在肝臟進行分解，通過MDA含量多少可間接判斷機體受到自由基損傷的程度[16]。

在28 ℃下，SOD活性變化趨勢類似“M”型趨勢，這與柳毅樊等[13]研究褐牙鲆的結(jié)果相類似，說明此溫度下銀鯧尚能夠通過機體調(diào)節(jié)機能，做出動態(tài)調(diào)節(jié)，逐漸適應環(huán)境溫度。同時CAT活性，MDA含量也在經(jīng)過0.5～1 d的短時間升高后，逐步下降到正常水平，說明銀鯧在28 ℃短期熱脅迫中能基本適應。

30 ℃脅迫下，CAT活性和MDA含量出現(xiàn)顯著上調(diào)后，均于第7天下降，且顯著低于正常水平。這與劉玲等(2018)研究駝背鱸(Cromileptesaltivelis)與鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)雜交子代短期熱刺激后，肝組織受到一定損傷，使細胞通透性下降，肝臟中CAT活性顯著下降的研究結(jié)果[17]相吻合。而SOD活性保持在較高的水平，這與徐冬冬等針對褐牙鲆的研究[10]不同，可能這與魚類的物種及脅迫溫度、時間等條件不同相關。因此，可推斷在30 ℃下，短期的高溫脅迫已經(jīng)對銀鯧機體產(chǎn)生了嚴重的損傷，養(yǎng)殖中表現(xiàn)為食欲顯著下降，魚體易受到驚嚇。

32 ℃高溫脅迫下，肝臟 MDA 含量隨應激時間的延長呈先上調(diào)后下降的趨勢。SOD與CAT活性在短時間內(nèi)也都呈上升的趨勢。強俊等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)在35 ℃高溫下，隨應激時間的延長，SOD和CAT二者活性均呈先上升后下降的變化[18]，這與本實驗的結(jié)果相一致。此外，在32 ℃脅迫7 d后，SOD、CAT二者活性和MDA含量均顯著低于正常水平和該時間點下其他2個溫度組。這說明，在32 ℃的短期高溫脅迫對銀鯧機體已產(chǎn)生致命性的損傷。事實上也可觀察到，當水溫高達32 ℃時，銀鯧處于高度緊迫狀態(tài)，狂游且極少進食，死亡率顯著上升，此時必須采用人工降溫手段調(diào)節(jié)水溫。

2.4.3 銀鯧肝組織hsp70基因表達對高溫脅迫的響應 大量研究結(jié)果顯示，在鼠尾藻(Sargassumthunbergii)[19]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[20]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[21]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[22]等眾多物種的研究中均發(fā)現(xiàn)熱刺激會引起hsp70基因的大量表達，且其表達水平的高低可以作為評價機體應激程度和應激能力的重要指標[23]。強俊等研究發(fā)現(xiàn)，溫度應激對羅非魚肝臟hsp70基因的表達水平有顯著影響，且隨應激時間的延長，hsp70基因的表達量在24 h內(nèi)基本呈先上升后下降的變化[18]，我們的實驗結(jié)果也是如此。此外，各溫度組下hsp70基因表達量在0.5天時有顯著差異，這也進一步說明銀鯧在不同的高溫脅迫下的應激響應存在顯著差異。

3 結(jié)論

通過研究不同高溫脅迫對銀鯧肝、鰓、腎的組織結(jié)構(gòu)、肝組織中氧化應激生化指標(SOD活性、CAT活性和MDA含量)和hsp70基因相對表達量的影響，結(jié)果顯示銀鯧在高溫脅迫初期即會迅速響應，且響應程度與脅迫強度存在正相關關系。在28 ℃下，銀鯧受到的高溫損傷較輕，且能逐步適應該溫度下的脅迫壓力；在30 ℃下，高溫脅迫對銀鯧嚴重損傷；而在32 ℃高溫脅迫下，銀鯧表現(xiàn)出強烈的應激響應，脅迫可對其造成致命損傷。