王琪，王欣

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

作為一種廣譜氯霉素類抗生素，氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)F)被廣泛用于治療豬、禽、牛以及水產(chǎn)等養(yǎng)殖動物的細(xì)菌性疾病[1]。但氟苯尼考會通過食源性生物富集而影響人體健康。氟苯尼考胺(florfenicol amine，F(xiàn)FA)是氟苯尼考在動物肝臟中存在時間最長且含量最高的代謝物，因此，一般將氟苯尼考胺作為動物源食品中氟苯尼考的標(biāo)示性殘留物之一[2]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]規(guī)定，在雞蛋、牛奶等產(chǎn)品中禁止檢出氟苯尼考，但由于部分養(yǎng)殖戶在雞的產(chǎn)蛋期中的違規(guī)用藥屢禁不止，因此，市售雞蛋中氟苯尼考?xì)埩舻臋z出時有發(fā)生。有必要對雞蛋中的氟苯尼考?xì)埩羲竭M(jìn)行檢測。

靈敏度高、選擇性好的高效液相色譜[4]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是氟苯尼考?xì)埩魴z測的首選方法[5]，但該類檢測一般需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理步驟，且需要價格昂貴的專業(yè)設(shè)備，難以應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測環(huán)節(jié)。因此，研究操作簡單、快速且便攜的氟苯尼考檢測方法很有必要?；诮鸺{米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)獨特的光學(xué)性能和極高的摩爾消光系數(shù)[6]設(shè)計的肉眼直接觀察的顯色探針有利于現(xiàn)場檢測結(jié)果的快速分析[7]。目前，該傳感器已在金屬離子[8]、蛋白質(zhì)[9]、DNA[10]以及小分子化合物[6]等多種靶標(biāo)的分析中得到應(yīng)用。此外，能與靶標(biāo)高親和力及選擇性結(jié)合的核酸適配體(aptamer，Apt)是一類新型的分子識別元件，特異性優(yōu)良，具有可批量合成、易于修飾及穩(wěn)定性好的優(yōu)點[11]。研究表明，適配體核酸堿基上N和O鍵與金納米可通過范德華力及疏水作用而結(jié)合[12]，這為金納米的適配體功能化及構(gòu)建具有識別特異性的比色傳感器提供了思路[13]。

一般情況下，納米金比色傳感器可通過肉眼觀察體系的顏色變化進(jìn)行定性或半定量檢測，但準(zhǔn)確性與靈敏性相對較低；借助于紫外分光光度計和酶標(biāo)儀的使用可以提高檢測的靈敏度，但專業(yè)設(shè)備需要技術(shù)支持與維護(hù)，多應(yīng)用于實驗室檢測。智能手機具有便攜性、現(xiàn)場圖像采集、數(shù)據(jù)處理和傳輸能力，若能將其與比色檢測相結(jié)合則可使比色傳感器的現(xiàn)場快速檢測更為便捷[14]。例如，CHEN等[15]探索了以智能手機讀取Hg2+比色試紙的顏色變化，并以藍(lán)值與紅值的比值作為指標(biāo)檢測池塘和河水中的Hg2+，該方法的檢出限為50 nmol/L，且實現(xiàn)了在現(xiàn)場短時間內(nèi)對多個樣品的快速檢測，使檢測效率大大提高。

基于以上分析，本研究以建立簡單、靈敏的氟苯尼考比色傳感快速分析技術(shù)為目標(biāo)，在合成氟苯尼考適配體功能化的金納米粒子(aptamer- gold nanoparticles，Apt-AuNPs)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化檢測條件，構(gòu)建基于Apt-AuNPs的氟苯尼考比色傳感器，驗證方法的特異性、穩(wěn)定性、靈敏度及在雞蛋中應(yīng)用的可行性。另外，對應(yīng)用智能手機成像分析(紅綠藍(lán)值分析)采集、識別和分析體系顏色變化的可行性進(jìn)行探索，為動物食品樣品中氟苯尼考的現(xiàn)場快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

氟苯尼考適配體序列為5′-GCTGTGTGACTCCTGCAAGGTCCATTCAAGTCGTAGGTTTGCCTTCAGCC-TCAACGCTTACGCAGCTGTATCTTGTCTCC-3′[16]，上海生工生物工程股份有限公司合成純化；氟苯尼考，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氟苯尼考胺，加拿大多倫多研究化學(xué)品公司；其余藥品：氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、正己烷、乙酸乙酯、甲砜霉素、四環(huán)素、氯霉素、阿莫西林、恩諾沙星、甲醇，上海麥克林化學(xué)試劑有限公司。加標(biāo)回收樣本雞蛋，上海本地超市；真實陽性樣本雞蛋，通過對產(chǎn)蛋期的蛋雞進(jìn)行預(yù)拌料方式連續(xù)給藥(20%氟苯尼考)所得。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Synergy H4型多功能酶標(biāo)儀，美國BioTek Instruments公司；NanoBrook 173Plus型動態(tài)光散射儀，美國Brookhaven公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；RV 10 basic型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；THZ-103B型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JJ-1型電動機械攪拌器，常州市蘇越實驗儀器廠；85-2A型恒溫磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；Sorvall ST8型高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；Zeta-sizer Nano ZS型激光粒度儀，英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金納米粒子的合成與表征

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法合成金納米粒子，在ZIEGLER等[17]方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。具體步驟如下：在100 mL煮沸的超純水中加入1.4 mL氯金酸溶液(20 mmol/L)并攪拌，隨后迅速加入1.2 mL檸檬酸三鈉溶液(100 mmol/L)在持續(xù)加熱下劇烈攪拌15 min，可觀察到溶液顏色在此過程中由灰色變?yōu)樯罴t色，最終呈透明酒紅色。停止加熱，攪拌溶液冷卻至室溫。12 000 r/min離心15 min除去多余的檸檬酸鈉，移除上清液后用超純水進(jìn)行重分散，4 000 r/min離心15 min，取上清液，得到AuNPs溶液，4 ℃低溫避光保存。

AuNPs的濃度的計算：取210 μL AuNPs與90 μL 超純水混合均勻，置于96孔板內(nèi)，以酶標(biāo)儀測量其在400～800 nm的吸收光譜。根據(jù)朗伯比爾定律，AuNPs的濃度計算如公式(1)所示：

A=εbc

(1)

式中：A，吸光度；ε，吸光系數(shù)或摩爾吸光系數(shù)，mol/(L·cm)；b，吸收介質(zhì)的厚度，cm；C，物質(zhì)濃度，mol/L。當(dāng)λ=520 nm時，AuNPs的ε為2.7×108mol/(L·cm)[18]。

1.2.2 檢測方法的性能分析

1.2.2.1 檢測方法的靈敏度評估

將210 μL的AuNPs溶液與30 μL適配體溶液(7 500 nmol/L)混合均勻后，37 ℃搖床孵育30 min，形成Apt-AuNPs溶液。再分別加入30 μL不同濃度的氟苯尼考(或氟苯尼考胺)溶液，使體系中氟苯尼考濃度(或氟苯尼考胺)為0～50 nmol/L，室溫孵育20 min后，加入30 μL NaCl溶液(500 mmol/L)，室溫反應(yīng)5 min。使用酶標(biāo)儀測量體系在400～800 nm的吸收光譜，以不添加目標(biāo)物的體系為對照，計算A650/A520及ΔA650/A520。

以氟苯尼考(或氟苯尼考胺)濃度為橫坐標(biāo)，ΔA650/A520為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。計算該方法的檢出限(limitation of detection，LOD)，對該比色傳感器的靈敏度進(jìn)行評估[19]，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：Sb，對照組A650/A520值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(11次重復(fù))；K，置信水平常數(shù)(K=3)；S，檢測物標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.2.2 檢測方法的特異性評估

以建立的方法分別對恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)、阿莫西林(amoxicillin，AMO)、氯霉素(chloramphenicol，CAP)、四環(huán)素(tetracycline，TC)、甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)體系進(jìn)行檢測，以不含目標(biāo)物的體系為對照，計算ΔA650/A520，并與氟苯尼考及氟苯尼考胺體系的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3 雞蛋樣品的前處理

以雞蛋為實際檢測樣品時，參照XIE等[1]方法對雞蛋進(jìn)行前處理。具體步驟如下：稱取1.5 g均質(zhì)后的雞蛋，置于聚丙烯離心管中，加入10 mL乙酸乙酯混合并漩渦振蕩1 min，超聲提取5 min，以4 000 r/min 離心5 min后，移取上清液，并以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃減壓濃縮。加入2 mL超純水進(jìn)行溶解，漩渦振蕩1 min，超聲提取5 min，加入3 mL正己烷，漩渦振蕩1 min，超聲提取5 min，以4 000 r/min離心5 min，移除上層正己烷相，移取下層水相供分析。

1.2.4 樣品的紅藍(lán)綠(red-green-blue, RGB)分析

使用智能手機(OXF-AN10，華為，中國深圳)對各體系的比色結(jié)果進(jìn)行提取與分析。具體步驟如下：手機與樣品保持水平，在高度約10 cm處記錄樣品圖像，使用色采APP (2.5.3版本)提取圖像中的RGB信息?；赗GB信息計算藍(lán)值/紅值(B/R)，利用B/R值與目標(biāo)物濃度繪制比色卡。以不含目標(biāo)物的體系為對照，計算ΔB/R。分別以氟苯尼考和氟苯尼考胺濃度為橫坐標(biāo)，ΔB/R為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

基于適配體功能化金納米的比色傳感器檢測氟苯尼考的原理如圖1所示。

圖1 基于核酸適配體功能化的納米金的比色傳感器檢測氟苯尼考的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the proposed colorimetric sensor for the detection of florfenicol with Apt-AuNPs as the indicator

圖1表明，核酸適配體堿基上N和O鍵與金納米間通過范德華力及疏水作用吸附于AuNPs表面[12]，從而形成Apt-AuNPs識別探針。當(dāng)體系中無目標(biāo)物(氟苯尼考或氟苯尼考胺)存在時，核酸適配體可以保護(hù)AuNPs，避免其在NaCl作用下發(fā)生聚集，使AuNPs在一定鹽濃度下仍保持分散狀態(tài)。當(dāng)體系含有目標(biāo)物時，由于目標(biāo)物與核酸適配體之間具有更強的親和力，核酸適配體則從AuNPs表面脫落，而失去適配體保護(hù)的AuNPs粒子在NaCl的作用下發(fā)生團(tuán)聚。其分散態(tài)到聚集態(tài)的轉(zhuǎn)變使體系的顏色從酒紅色變?yōu)樽霞t色，最終變?yōu)樗{(lán)灰色。這一顏色變化可通過肉眼識別、比色檢測或使用智能手機等便攜式設(shè)備進(jìn)行顏色分析。樣品顏色的變化程度又取決于目標(biāo)物的濃度，因此可通過樣品體系顏色變化與目標(biāo)物濃度的變化規(guī)律實現(xiàn)對樣品中目標(biāo)物(氟苯尼考或氟苯尼考胺)的檢測。

2.2 AuNPs的表征及檢測原理的驗證

為證明成功制備金納米粒子及所得的金納米粒子的光學(xué)特性、粒徑及微觀形貌適合比色傳感器的構(gòu)建，對其進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。圖2-a～圖2-c分別是金納米粒子的紫外可見吸收光譜、粒徑分布圖及透射電鏡圖。圖2-e為表面ζ-電位變化結(jié)果，表明適配體吸附于金納米離子表面。同時，為了證明所提出的檢測方法的可行性，對該方法的原理進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖2及表1所示。

表1 不同體系的平均水合粒徑及PDI結(jié)果Table 1 The average diameter and PDI of different nanoparticles system

由圖2-a的紫外吸收光譜及樣品顏色變化結(jié)果可知，所制備的金納米溶液呈紅色，由于表面特征等離子體共振，金納米粒子在λ=520 nm處呈現(xiàn)明顯的金特征吸收峰，吸光度為0.375±0.021。通過朗伯比爾定律[18]計算得AuNPs溶液濃度約為1.5 nmol/L。如圖2-b及表1所示，AuNPs的平均水合粒徑為(21.42±0.48) nm，多分散性指數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.08±0.01，說明所制備的AuNPs在溶液中呈單分散狀態(tài)，粒徑分布均勻。由圖2-c AuNPs的透射電鏡圖像可知，所得到的AuNPs呈大小均一(約15 nm)的規(guī)則球體，分散性良好，可用于比色傳感器的構(gòu)建。由圖2-e可知，裸露的金納米粒子表面ζ-電位為(-62.77±1.72) mV，當(dāng)金納米粒子與適配體孵育30 min后，表面ζ-電位為(-48.10±0.70) mV，這是由于金納米粒子與適配體發(fā)生結(jié)合而使金表面的檸檬酸根的負(fù)電荷被中和，從而使ζ-電位絕對值相對減小[6]。

a-不同體系的紫外可見吸收光譜及顏色變化；b-不同體系的粒徑分布圖；c-分散態(tài)金納米粒子的透射電鏡圖像；d-聚集態(tài)金納米粒子的透射電鏡圖像；e-金納米適配體吸附前后的ζ-電位變化圖2 金納米粒子的表征及檢測原理的驗證Fig.2 Characterization of AuNPs and verification of detection principle

與不含NaCl的AuNPs溶液體系相比，當(dāng)體系中有NaCl存在時，AuNPs溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)灰色，體系在520 nm處的吸收峰降低，而在670 nm處出現(xiàn)了顯著的吸收峰。與此同時，AuNPs的平均水合粒徑增大至(495.28±25.90) nm，PDI增大至0.24±0.03。說明在NaCl的作用下, AuNPs由分散態(tài)變?yōu)榫奂瘧B(tài)。而Apt-Au在含有NaCl的體系中時，溶液顏色、紫外吸收光譜、平均水合粒徑及PDI均與不含NaCl的AuNPs體系相近，這證明了適配體吸附于AuNPs表面可起到一定的保護(hù)作用，使AuNPs在一定濃度的NaCl下仍保持分散態(tài)。當(dāng)加入不同濃度的氟苯尼考后，體系的水合粒徑及PDI均相對增大，例如，當(dāng)體系中含有0.1 nmol/L的氟苯尼考時，體系的水合粒徑增加至(36.86±1.51) nm，PDI 增大至0.21±0.01，說明AuNPs開始發(fā)生團(tuán)聚。由含50 nmol/L氟苯尼考體系的透射電鏡圖像(圖2-d)可知，此時的AuNPs發(fā)生明顯團(tuán)聚而形成團(tuán)簇。以上結(jié)果證明所提出的比色傳感器具有可行性，且溶液的顏色變化與目標(biāo)物濃度存在聯(lián)系。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 NaCl濃度的優(yōu)化

在所設(shè)計的比色傳感器中，NaCl濃度對AuNPs的團(tuán)聚有重要影響。NaCl濃度對AuNPs體系的A650/A520的影響如圖3所示。

圖3 不同NaCl濃度下AuNPs的A650/A520變化Fig.3 A650/A520 of system under different NaCl concentration注：不同小寫字母表示差異顯著

圖3表明，隨著NaCl濃度從0 mmol/L增加至50 mmol/L時，體系的A650/A520由0.174 2±0.004 0顯著增大至1.342 2±0.003 0。當(dāng)NaCl濃度進(jìn)一步增大，A650/A520的變化則趨于平坦，這說明當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時，已使體系中的AuNPs發(fā)生明顯團(tuán)聚，故選擇50 mmol/L的NaCl用于后續(xù)檢測。

2.3.2 適配體濃度的優(yōu)化

適配體濃度對傳感器的靈敏性與穩(wěn)定性有重要影響。適配體濃度對體系A(chǔ)650/A520及ΔA650/A520的影響如圖4所示。

a-不同濃度適配體對體系A(chǔ)650/A520的影響；b-不同濃度適配體對體系ΔA650/A520的影響圖4 適配體濃度對體系的影響Fig.4 The effect of aptamers concentration on the response of system

圖4-a表明，當(dāng)適配體濃度從150 nmol/L增加至750 nmol/L，空白對照組的A650/A520發(fā)生降低，從0.504 0±0.011 5減少至0.235 3±0.004 3，隨著適配體濃度的進(jìn)一步增大，空白對照組的A650/A520的變化趨于平坦。這是由于，隨著適配體濃度的增大，有利于保護(hù)粒子避免發(fā)生聚集，故A650/A520相對減小。當(dāng)適配體達(dá)到750 nmol/L時，吸附于AuNPs表面的適配體趨于飽和，進(jìn)一步增大適配體濃度無法提高保護(hù)作用，故A650/A520無明顯變化。此結(jié)果與KIM等[20]研究一致，隨著適配體與金納米比例的增大，溶液A650/A520減小，且當(dāng)適配體與金納米粒子比例達(dá)50∶1時，適配體保護(hù)金納米粒子避免鹽誘導(dǎo)聚集。試驗組的A650/A520亦隨著適配體濃度的增大而相對降低，當(dāng)適配體濃度由150 nmol/L增加至1 650 nmol/L時，A650/A520從0.558 2±0.006 0減少至0.274 4±0.001 7。這是由于，隨著適配濃度的增加，吸附于AuNPs表面的適配體趨于飽和，溶液中游離的適配體增加并與目標(biāo)物結(jié)合[20]，故從AuNPs表面脫落與目標(biāo)物結(jié)合的適配體數(shù)量越少，AuNPs表面剩余的適配體相對較多，有助于粒子穩(wěn)定性的保持，因此即使在NaCl的作用下，AuNPs發(fā)生團(tuán)聚的程度相對減小，表現(xiàn)為體系A(chǔ)650/A520的降低。

ΔA650/A520可以更加清晰地反映AuNPs團(tuán)聚程度的變化。由圖4-b可知，隨著適配體濃度的增大，體系的ΔA650/A520先增大再減小，當(dāng)適配體濃度為750 nmol/L時，ΔA650/A520最大，為0.166 8±0.003 0。這說明，當(dāng)適配體濃度為750 nmol/L時，一方面保證有足夠的適配體吸附于AuNPs，避免其在NaCl的作用下直接產(chǎn)生聚沉而產(chǎn)生假陽性，另一方面又避免了體系中存在過多的適配體而影響傳感器的靈敏度。因此，適配體濃度為750 nmol/L時更利于后續(xù)檢測。

2.3.3 NaCl孵育時間的優(yōu)化

NaCl與體系的孵育時間會影響AuNPs聚集，故在優(yōu)化的NaCl及適配體濃度的基礎(chǔ)上，研究NaCl的孵育時間對體系A(chǔ)650/A520及ΔA650/A520的影響，結(jié)果如圖5所示。

a-NaCl不同孵育時間對體系A(chǔ)650/A520的影響；b-NaCl不同孵育時間對體系ΔA650/A520的影響圖5 NaCl孵育時間對體系的影響Fig.5 The effect of NaCl incubation time on the response of system

圖5-a表明，隨著樣品體系與NaCl孵育時間的延長，空白對照組及試驗組的A650/A520均相對增大。其中，空白組的變化相對較小，僅由0.226 2±0.004 9增大至0.274 7±0.003 4，表明仍呈良好分散狀態(tài)；而試驗組的A650/A520迅速增大，在孵育5 min內(nèi)已由0.270 6±0.008 9增大至0.409 5±0.001 6，隨后變化趨緩，說明隨著作用時間的延長，AuNPs的團(tuán)聚程度增加，5 min時大部分AuNPs可形成團(tuán)簇。由圖5-b可知，隨NaCl孵育時間從1 min增加至5 min， 體系的ΔA650/A520從0.044 4±0.012 1顯著增加至0.168 8±0.003 0，但繼續(xù)延長時間后，ΔA650/A520則相對減少(P<0.05)。故后續(xù)試驗中NaCl與體系孵育時間應(yīng)為5 min。

2.3.4 目標(biāo)物反應(yīng)時間的優(yōu)化

目標(biāo)物與體系的反應(yīng)時間會對目標(biāo)物和適配體的結(jié)合程度產(chǎn)生影響，從而影響體系中AuNPs的聚集程度及檢測效果。不同目標(biāo)物反應(yīng)時間對體系A(chǔ)650/A520及ΔA650/A520的影響如圖6所示。

a-不同目標(biāo)物反應(yīng)時間對體系A(chǔ)650/A520的影響；b-不同目標(biāo)物反應(yīng)時間對體系ΔA650/A520的影響圖6 目標(biāo)物反應(yīng)時間時間對體系的影響Fig.6 The effect of target reaction time on the response of system

圖6-a表明，隨反應(yīng)時間從0 min延長至20 min時，空白對照組的A650/A520在孵育過程中無顯著改變；而試驗組的A650/A520則由0.246 1±0.002 4 增加至0.416 1±0.007 6，說明隨反應(yīng)時間的延長，更多的適配體從AuNPs表面脫落并與目標(biāo)物結(jié)合，使AuNPs在NaCl的作用下團(tuán)聚程度增大，A650/A520增加。但繼續(xù)延長反應(yīng)時間至25 min時，體系的A650/A520則相對降低，為0.356 1±0.004 3，這一變化與WU等[6]在優(yōu)化比色傳感器氯霉素和四環(huán)素反應(yīng)時間中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律相似。這可能與一些脫落下來未和目標(biāo)物結(jié)合緊密的適配體重新吸附于AuNPs表面有關(guān)，使得后續(xù)加入NaCl進(jìn)行反應(yīng)時，AuNPs的聚集程度有所減小。

由圖6-b可知，隨著反應(yīng)時間的延長，體系的ΔA650/A520先增大后減小。0 min時，由于目標(biāo)物與適配體還未充分反應(yīng)，因此ΔA650/A520變化相對較小，僅為0.010 8±0.004 3。隨著反應(yīng)時間的延長，目標(biāo)物與適配體反應(yīng)程度加大，ΔA650/A520顯著增大(P<0.05)，并在反應(yīng)20 min時達(dá)到峰值(0.180 8±0.010 6)。因此，選擇目標(biāo)物與體系反應(yīng)時間為20 min。

2.4 檢測方法靈敏度評估

為了評估所構(gòu)建的比色傳感器的靈敏度，在確定的檢測條件下檢測不同濃度(0.1～45 nmol/L)氟苯尼考及氟苯尼考胺，建立ΔA650/A520與目標(biāo)物濃度間的線性關(guān)系。

如圖7-a所示，隨著氟苯尼考濃度從0.1 nmol/L增大至45 nmol/L，ΔA650/A520從0.013 3±0.000 4增加到0.880 2±0.027 2。由圖7-b可知，在20～40 nmol/L，氟苯尼考濃度與ΔA650/A520呈良好的線性關(guān)系，其線性方程如公式(3)所示：

yFF=0.031 6x-0.465 3(R2=0.999 2)

(3)

由圖7-c可知，隨著氟苯尼考胺的濃度增加，ΔA650/A520從0.021 1±0.002 6逐漸增加到0.928 5±0.005 7。如圖7-d所示，在20～45 nmol/L，氟苯尼考胺濃度與ΔA650/A520呈良好的線性關(guān)系，其線性方程如公式(4)所示：

yFFA=0.027 2x-0.325 8 (R2=0.985 4)

(4)

進(jìn)一步計算檢測限，氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢測限分別為5.41 nmol/L (1.94 μg/kg)和6.29 nmol/L (1.56 μg/kg)。

a-Δ A650/A520隨氟苯尼考濃度的變化曲線；b-氟苯尼考的工作曲線；c-ΔA650/A520隨氟苯尼考胺濃度的變化曲線；d-氟苯尼考胺的工作曲線圖7 Apt-AuNPs比色傳感器檢測氟苯尼考及氟苯尼考胺的靈敏度評估Fig.7 Sensitivity of the colorimetric sensor for florfenicol detection

2.5 檢測方法特異性評估

檢驗方法的特異性是其性能的重要指標(biāo)。以所構(gòu)建的比色傳感器對氟苯尼考、氟苯尼考胺及5種抗生素(恩諾沙星、阿莫西林、氯霉素、四環(huán)素、甲砜霉素)進(jìn)行檢測，評價該比色傳感器的檢測特異性，結(jié)果如圖8所示。

圖8表明，當(dāng)檢測物濃度為45 nmol/L時，氟苯尼考及氟苯尼考胺的ΔA650/A520分別為0.880 2±0.027 2 和0.928 5±0.005 7，顯著高于其他5種抗生素(P<0.05)，如恩諾沙星(0.085 2±0.008 3)、阿莫西林(0.059 3±0.007 1)、氯霉素(0.090 5±0.008 0)、四環(huán)素(0.060 6±0.005 6)。即使與氟苯尼考的結(jié)構(gòu)極為類似的甲砜霉素，其ΔA650/A520(0.350 9±0.009 7)仍顯著低于目標(biāo)物組(P<0.05)。為了驗證當(dāng)干擾物濃度大于目標(biāo)物濃度時方法的特異性，將干擾物的濃度增大到4 500 nmol/L時發(fā)現(xiàn)，其他5種抗生素的ΔA650/A520仍顯著低于目標(biāo)物(P<0.05)。其中，恩諾沙星、阿莫西林、氯霉素、四環(huán)素、甲砜霉素的ΔA650/A520分別為0.124 0±0.006 1、0.116 3±0.006 2、0.143 1±0.005 1、0.124 9±0.005 7及0.363 9±0.005 7，這表明，即使在此濃度下，方法仍具有良好的特異性。

圖8 Apt-AuNPs比色傳感器檢測氟苯尼考及氟苯尼考胺的特異性評估Fig.8 Selectivity of the colorimetric sensor for florfenicol detection

2.6 雞蛋樣品的加標(biāo)回收

以雞蛋為實際樣本進(jìn)行加標(biāo)回收檢測試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可知，氟苯尼考的回收率為98.65%～103.40%，RSD為0.24%～1.44%；氟苯尼考胺的回收率為98.35%～107.49%，RSD為0.07%～6.78%。結(jié)果表明，該比色傳感器在雞蛋樣品的檢測具有準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，可以很好地低應(yīng)用于實際樣品的現(xiàn)場檢測。

表2 氟苯尼考及氟苯尼考胺的加標(biāo)回收結(jié)果Table 2 Recoveries of florfenicol in egg samples

2.7 樣品的RGB分析

為了提高檢測方法的便捷性，實現(xiàn)在資源有限或?qū)嶒炇乙酝獾默F(xiàn)場高通量檢測，本研究利用智能手機軟件對檢測體系的顏色變化進(jìn)行讀取和RGB分析，結(jié)果如圖9所示。

a-氟苯尼考濃度變化的比色卡；b-氟苯尼考濃度對ΔB/R的影響；c-氟苯尼考濃度與ΔB/R的工作曲線；d-氟苯尼考胺濃度變化的比色卡；e-氟苯尼考胺濃度對ΔB/R的影響；f-氟苯尼考胺濃度與ΔB/R的工作曲線圖9 Apt-AuNPs比色傳感器RGB分析結(jié)果Fig.9 RGB analysis with the smartphone

圖9-a及圖9-d表明，隨著氟苯尼考及氟苯尼考胺濃度的增加，溶液從紅色變?yōu)樽仙僮優(yōu)樗{(lán)灰色，智能手機讀取圖像中的B/R(藍(lán)色/紅色)值也逐漸增大。由圖9-b及圖9-e可知， 體系的ΔB/R值與目標(biāo)物濃度密切相關(guān)。當(dāng)氟苯尼考由0.1 nmol/L增大至45 nmol/L時，體系的ΔB/R由0.01增大至0.388；當(dāng)氟苯尼考胺由0.1 nmol/L增大至45 nmol/L時，體系的ΔB/R由0.02增大至0.423。同時，如圖9-c和圖9-f所示，在20～45 nmol/L，ΔB/R與目標(biāo)物濃度呈良好線性關(guān)系，氟苯尼考和氟苯尼考胺的線性回歸方程分別如公式(5)和公式(6)所示：

yFF=0.012 5x-0.164 5(R2=0.992 0)

(5)

yFFA=0.011 8x-0.125 9(R2=0.974 7)

(6)

與比色分析相比，雖然ΔB/R值與目標(biāo)物的相關(guān)性稍低，但是該方法可借助于智能手機進(jìn)行更為便捷的現(xiàn)場快速分析，操作更為簡便，這也具有一定的實際應(yīng)用價值。

2.8 真實樣品的檢測

為了驗證所構(gòu)建的比色傳感器在實際樣品檢測中應(yīng)用可行性，對產(chǎn)蛋期的蛋雞進(jìn)行預(yù)拌料方式連續(xù)給藥(20%氟苯尼考)5 d，收集所產(chǎn)雞蛋進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖10及表3所示。

圖10 真實樣品檢測結(jié)果Fig.10 Real samples detection of florfenicol in eggs

表3 真實雞蛋樣品中氟苯尼考?xì)埩袅康臋z測 單位：μg/kg

圖10表明，利用所建立的Apt-AuNPs比色傳感器可以有效監(jiān)測雞蛋中氟苯尼考隨給藥天數(shù)的變化。其中，第5天的雞蛋氟苯尼考含量超過此傳感器的線性范圍，故先進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測分析。如表3所示，根據(jù)公式(3)計算所得雞蛋中氟苯尼考的殘留量由(7.31±0.05) μg/kg增加到(28.00±0.14) μg/kg，公式(4)計算所得氟苯尼考?xì)埩袅坑?6.66±0.06) μg/kg增加到(28.86±0.16) μg/kg。根據(jù)RGB分析公式(5)計算所得雞蛋氟苯尼考?xì)埩袅坑?7.41±0.34) μg/kg增加到(25.62±0.13) μg/kg，公式(6)計算所得雞蛋氟苯尼考?xì)埩袅坑?6.67±0.36) μg/kg增加到(24.80±0.13) μg/kg。不同分析式計算結(jié)果基本一致，且與張靜等[21]報道的雞蛋氟苯尼考?xì)埩袅侩S給藥天數(shù)變化的趨勢一致。檢測結(jié)果表明，比色傳感器具有檢測實際樣品的能力。

2.9 檢測方法的對比

表4列出了目前部分氟苯尼考的檢測方法的檢測物、檢出限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等信息。相比之下，本研究中所建立的比色傳感器對氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢出限(1.94 μg/kg和1.56 μg/kg)優(yōu)于傳統(tǒng)的高效液相色譜法[22]和熒光傳感器[16]。而與更為靈敏的液相串聯(lián)質(zhì)譜法[1]、酶聯(lián)免疫[23]及高效液相熒光檢測方法[24]相比，本比色傳感器則顯示出了更好的回收率(98.35%～107.49%)。低于6.78%的標(biāo)準(zhǔn)偏差也顯示了此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

表4 氟苯尼考檢測方法的對比 單位：μg/kg

3 結(jié)論與討論

本研究構(gòu)建了基于適配體功能化的納米金比色傳感器，在優(yōu)化檢測條件的基礎(chǔ)上，評估了傳感器的靈敏性、特異性及對雞蛋中氟苯尼考檢測的可行性，進(jìn)而探索了借助于智能手機的成像分析進(jìn)行現(xiàn)場快速分析的可行性。比色傳感器的優(yōu)化條件如下：NaCl濃度為50 mmol/L，NaCl孵育時間為5 min，適配體濃度為750 nmol/L，目標(biāo)物與體系的反應(yīng)時間為20 min。在此條件下，ΔA650/A520與氟苯尼考的濃度(20～40 nmol/L)、氟苯尼考胺的濃度(20～45 nmol/L)均呈良好線性關(guān)系，檢測限分別為5.41 nmol/L和6.29 nmol/L，傳感器具有良好的特異性。雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的加標(biāo)回收率分別為98.65%～103.40%和98.35%～107.49%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.78%。智能手機紅藍(lán)綠分析結(jié)果表明，ΔB/R與氟苯尼考及氟苯尼考胺均存在良好的線性關(guān)系，R2分別為0.992 0 和0.974 7，故以ΔB/R為指標(biāo)可實現(xiàn)智能手機的快速檢測。所建立的Apt-AuNPs比色傳感器可以有效監(jiān)測雞蛋中氟苯尼考隨給藥天數(shù)的變化，證實了該方法在實際樣品分析應(yīng)用的可行性?？傮w而言，本研究中所建立的比色傳感器對氟苯尼考具有較高的檢測靈敏度和特異性，且簡單快速，具有良好的應(yīng)用價值，可應(yīng)用于實際畜、禽食品中的氟苯尼考的現(xiàn)場快速篩查檢測。