徐毓謙，郭美，劉貴珊，袁江濤，郭佳俊

(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

隨著我國(guó)人民生活水平的提高，調(diào)理肉制品正逐漸成為我國(guó)肉類(lèi)消費(fèi)的主流[1-2]。調(diào)理肉制品在貯藏過(guò)程中所含水分和肌原纖維蛋白質(zhì)會(huì)不斷流失[2-3]，失去肉制品原本的彈性和保水能力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的冷凍變性[3]。如何在冷凍過(guò)程中保證肉制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是亟待解決的難題[4]。目前，在冷凍肉品中加入抗凍保護(hù)劑是抑制肉制品蛋白質(zhì)冷凍變性的方法之一。一般情況下，抗凍保護(hù)劑可以有效溶解冰晶，阻斷冰晶生長(zhǎng)，防止肌原纖維蛋白功能和結(jié)構(gòu)的改變，減少產(chǎn)品品質(zhì)劣變，提高食品貯藏品質(zhì)[5]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗凍保護(hù)劑的研究大多停留在定性描述的能力分析，且處于傳統(tǒng)抗凍保護(hù)劑的應(yīng)用階段，對(duì)于新型蛋白質(zhì)水解物抗凍保護(hù)劑研究尚未進(jìn)行深入研究。本文針對(duì)調(diào)理牛肉餅在冷凍期間的變化進(jìn)行深入研究，測(cè)定其水分和肌原纖維蛋白等含量變化，探究抗凍劑牛皮膠原蛋白對(duì)調(diào)理牛肉餅中水分和肌原纖維蛋白質(zhì)的保護(hù)能力，為調(diào)理牛肉餅冷凍期間品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取牛后腿肉作為主要原料，采用保鮮膜包裝，4 ℃ 保存。

牛皮膠原蛋白，西安卓瑞生物科技有限公司；Tris-maleate，雷根生物；氯化鉀、氯化鈣，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；ATP粉劑、偏鉬酸銨，上海山浦化工有限公司；高氯酸，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；鉬酸銨，徐州天鴻化工有限公司；雙縮脲法試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JI-1精密增力電動(dòng)攪拌器、國(guó)華電器有限公司；752 N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，上海盧相儀離心機(jī)儀器有限公司；Testo 205型便攜式pH計(jì)，德國(guó)德圖(深圳)有限公司；WSC-S色差儀，北京精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

先使用4～10 ℃的清水漂洗原料肉2次，每次2 min。將肉切割成1 cm3的肉塊，去除表面的血絲等。于-24 ℃的冰箱中進(jìn)行凍藏，保證肉品中心溫度迅速凍結(jié)到-18 ℃。

1.3.2 測(cè)定條件

分別測(cè)定在-24 ℃凍藏7 d和30 d牛肉餅的指標(biāo)變化。另外測(cè)定牛肉餅在凍融循環(huán)2、4、6次條件下的指標(biāo)變化(-24 ℃凍藏24 h，4 ℃解凍6 h記1次循環(huán))，設(shè)置空白對(duì)照組，即4 ℃下新鮮肉。

1.3.3 牛肉餅加工工藝

采用孟子晴等[9]的制作方法，略有修改。按工藝要求修整肉塊，去除表面的脂肪、筋腱、軟骨以及結(jié)締組織，手動(dòng)攪碎制成肉糜，以1個(gè)牛肉餅的肉重記為 1，以噴灑的方式加入2%、4%、6%、8%(質(zhì)量份數(shù))的牛皮膠原蛋白，2%(質(zhì)量份數(shù))食鹽、0.3%(質(zhì)量份數(shù))復(fù)合磷酸鹽，攪拌均勻后4 ℃冷藏成型為直徑 6 cm，厚1 cm，內(nèi)無(wú)氣泡的肉餅，生牛肉糜餅速凍后貯存于-24 ℃冰箱。生牛肉指標(biāo)于4 ℃解凍5 h，待測(cè)。

1.3.4 解凍損失率的測(cè)定

取樣品30 g，使用濾紙擦干表面殘留的水分，每個(gè)處理組至少重復(fù)測(cè)定3次[10]，解凍損失率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 pH的測(cè)定

選用樣品，利用Testo 205型便攜式pH計(jì)，測(cè)定樣品在冷凍期內(nèi)pH值的變化情況，且每個(gè)處理組至少重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.6 色澤的測(cè)定

利用CM-2300 d型分光測(cè)色計(jì)，測(cè)定樣品在冷凍期內(nèi)表面顏色參數(shù)的變化情況。為保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，樣品測(cè)定前需對(duì)分光測(cè)色計(jì)進(jìn)行白板校正和零校正。樣品測(cè)定時(shí)，在樣品表面選擇3處不同地方進(jìn)行測(cè)定，并記錄L*(亮度值)、a*(紅度值)和b*(黃度值)的示數(shù)，最終分別計(jì)算每組顏色參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)處理組至少重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.7 鹽溶性蛋白溶解量的測(cè)定

參考宋蕾[10]的測(cè)定方法，使用雙縮脲試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.8 鹽溶性蛋白凝膠保水性測(cè)定

參考趙子瑞[11]的測(cè)定方法，將50 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液放入10 mL的離心管中，以1 min上升1 ℃ 的加熱速率從20 ℃水浴加熱到75 ℃，并在75 ℃保持30 min后用流水立即冷卻，放入4 ℃冰箱12 h。使用離心法測(cè)定凝膠保水性。準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g凝膠至5 mL 的離心管中，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液。分別記錄離心前后離心管和凝膠的總重。凝膠保水性是指離心后總重占離心前總重的百分比(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.3.9 Ca2+-腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase，ATPase)活力測(cè)定

參考梁鵬等[12]的方法，略作修改，稱(chēng)取樣品20 g，加入0.6 mol/L NaCl溶液80 mL，在4 ℃ 8 000 r/min高速勻漿30 min后在4 ℃條件下靜置24 h；使用雙層紗布過(guò)濾，粗濾液經(jīng)4 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液。肌原纖維蛋白溶液制備出后，在試管中加入0.5 mL 0.5 mol/L Tris-馬來(lái)酸、0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2、2.2 mL 2.0 mol/L KCl、0.5 mL 20 mmol/L ATP(pH 7.0)、1.0 mL肌原纖維蛋白溶液和5.3 mL蒸餾水。反應(yīng)混合液在25 ℃恒溫中水浴，加入酶液后反應(yīng)開(kāi)始，反應(yīng)5 min后加入5 mL 15%(體積分?jǐn)?shù))高氯酸終止反應(yīng)。空白組為先加入5 mL 15%高氯酸，再加入其他溶液。采用釩鉬黃比色法測(cè)定反應(yīng)中釋放的無(wú)機(jī)磷含量，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。Ca2+-ATPase的活性以1 mg蛋白質(zhì)在1 min內(nèi)生成的微摩爾Pi來(lái)表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 Design Expert 8.0.6、Origin 2017 和 SPSS 21對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)解凍損失率的影響

解凍損失率是肉制品品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，影響著肉制品表面微生物群的活化和增殖，降低酶的活性，對(duì)肉制品的品質(zhì)測(cè)定產(chǎn)生負(fù)面影響[2，13]。由圖1可知，新鮮牛肉的解凍損失率為10.09%；在固定溫度的冷凍貯藏下，解凍損失率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這與錢(qián)書(shū)意等[14]的研究結(jié)果相符，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是由于在貯藏過(guò)程中，冷凍牛肉餅中自由水形成冰晶，在解凍時(shí)冰晶所化的水沒(méi)有充分的時(shí)間重新被肌肉組織吸收，導(dǎo)致水分流失；在凍融循環(huán)的過(guò)程中，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，解凍損失率不斷增大，且解凍損失率更高，這是由于凍融循環(huán)過(guò)程中，樣品中水分冷凍形成冰晶體，解凍后冰晶體被破壞，導(dǎo)致肌肉發(fā)生不可逆機(jī)械損傷，水分流失嚴(yán)重[15]，這與蒙健宗等[16]和ZHANG等[17]的研究結(jié)果相吻合。在相同的貯藏時(shí)間內(nèi)，加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，發(fā)現(xiàn)在6%的添加量下解凍損失率最低，且顯著低于其他含量(P<0.05)，最高可提高15.74%，這可能由于牛皮膠原蛋白作為一種蛋白質(zhì)水解物，可以應(yīng)用滯后效應(yīng)，降低冰點(diǎn)且改變冰晶形態(tài)，從而抑制冰晶生長(zhǎng)[15-17]。以上結(jié)果表明，牛皮膠原蛋白可以修飾冰晶降低其冰點(diǎn)，通過(guò)將大冰晶減少為小冰晶，抑制了在凍融循環(huán)下的重結(jié)晶。

圖1 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)不同貯藏條件下解凍損失率的影響Fig.1 Effect of different amount of bovine collagen on thawing loss rate in different storage condition注：圖中同一組中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)pH值和色澤的的影響

肉制品pH的高低可以反映肉制品品質(zhì)的好壞[18-19]。新鮮肉品的初始pH值為6.20，由表1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，pH不斷降低，可能是由于肌肉中糖類(lèi)發(fā)酵分解產(chǎn)生的乳酸和ATP產(chǎn)生的磷酸不斷增加，導(dǎo)致pH的降低[19]；在凍融循環(huán)過(guò)程中，pH值隨著凍融循環(huán)的次數(shù)增加而降低，且降低速度相較于短期和長(zhǎng)期貯藏更快(P<0.05)，并在循環(huán)6次時(shí)最低。這可能是由于低溫冷凍抑制了牛肉餅表面微生物的生長(zhǎng)和酶的活性，生成的堿性物質(zhì)較少，pH未升高[19]。加入不同含量牛皮膠原蛋后實(shí)驗(yàn)組中肉制品的pH與對(duì)照組相比變化不顯著，這可能是由于牛皮膠原蛋白對(duì)酸性物質(zhì)沒(méi)有抑制作用，且對(duì)堿性物質(zhì)無(wú)促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，導(dǎo)致pH不受其影響。

表1 冷凍牛肉餅pH和色澤參數(shù)比較Table 1 Comparison of pH and color parameters of frozen beef cakes

肉制品的顏色是消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品時(shí)考慮的重要因素之一，也是評(píng)價(jià)凍藏肉制品的重要指標(biāo)[20]。由表1可知，在7 d和30 d的貯藏期中，L*值和b*值增大但變化不顯著，a*值減小且變化顯著(P<0.05)，這可能是由于在低溫冷凍過(guò)程中，低溫降低了氧合肌紅蛋白的氧化速率，暗褐色的高鐵肌紅蛋白的生成過(guò)程受到抑制，使肉制品呈現(xiàn)較好的肉色；在凍融循環(huán)過(guò)程中，L*值先增大后減小，a*值逐漸減小，在凍融6次時(shí)顯著減少(P<0.05)，b*值逐漸增大，在凍融6次時(shí)顯著增大(P<0.05)，這與李金平等[21]研究結(jié)果相吻合，這可能是由于凍融循環(huán)條件下牛肉餅的汁液損失增大，導(dǎo)致前期的L*值不斷增大，色澤相對(duì)于初始更鮮亮，但在凍融循環(huán)后期，牛肉表面的肌紅蛋白被氧化，形成褐色的高鐵肌紅蛋白，導(dǎo)致色澤變暗，這與QI等[22]的結(jié)果相符。而加入不同含量牛皮膠原蛋白后產(chǎn)生了部分變化，但變化不顯著，出現(xiàn)這種情況的原因可能是牛皮膠原蛋白對(duì)肉中呈色的肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白無(wú)影響，導(dǎo)致肉色變化不顯著。

2.3 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)鹽溶性蛋白溶解量的影響

鹽溶性蛋白是主要的肌肉蛋白質(zhì)[23-24]，顯著影響著蛋白質(zhì)的功能特性，其變性會(huì)導(dǎo)致肉制品的劣變。由圖2可知，鹽溶性蛋白溶解量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，經(jīng)顯著性分析可知，在短期、長(zhǎng)期和凍融循環(huán)下鹽溶性蛋白溶解量下降程度均顯著低于新鮮肉，這是由于在凍藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其分子間的氫鍵和疏水鍵導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加，蛋白質(zhì)無(wú)法充分吸附水分從而增加了鹽溶性蛋白不穩(wěn)定性[24]，在凍融循環(huán)狀態(tài)下，鹽溶性蛋白下降顯著(P<0.05)。這可能是由于在循環(huán)解凍過(guò)程中，水不斷生成冰晶擠壓蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致肉制品的可溶性蛋白含量減少，食用品質(zhì)降低，這與LEE等[24]研究結(jié)果相符。LEYGONIE等[25]發(fā)現(xiàn)冷凍過(guò)程中冰晶的形成和生長(zhǎng)破壞了肉的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，且蛋白結(jié)構(gòu)周?chē)娜苜|(zhì)濃度增大，導(dǎo)致蛋白變性，引起肉制品的劣變。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。在加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，各組的蛋白質(zhì)含量均有顯著提升，對(duì)比新鮮肉，鹽溶性蛋白含量隨著牛皮膠原蛋白添加量的提高而上升，且在6%的添加量下蛋白質(zhì)含量維持得最好，最高可提高25.79%。相對(duì)于短期和長(zhǎng)期凍藏，蛋白質(zhì)含量在凍融循環(huán)中上升較快。說(shuō)明牛皮膠原蛋白可以有效地延緩了鹽溶性蛋白溶解量下降的問(wèn)題，一方面可能是通過(guò)增強(qiáng)其蛋白質(zhì)和水之間的結(jié)合，減少蛋白質(zhì)間的不可逆結(jié)合，這與下一節(jié)的結(jié)果相呼應(yīng)，另一方面，牛皮膠原蛋白作為大分子化合物，加入后可以提高非凍結(jié)相的含量及濃度，自由水等凍結(jié)相濃度相對(duì)降低，且維持蛋白質(zhì)分子的水合環(huán)境穩(wěn)定，減緩蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)作用力的平衡被破壞的現(xiàn)象。在加入牛皮膠原蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可以和肉糜均勻混合在一起，呈透明態(tài)，具有一定黏性，猜測(cè)可以在混合狀態(tài)時(shí)在肉糜間形成隔膜類(lèi)的屏障，阻礙各相間的反應(yīng)，從而減緩鹽溶性蛋白溶解量在低溫和溫度波動(dòng)狀態(tài)下的下降情況。

圖2 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)不同貯藏條件下鹽溶性蛋白溶解量的影響Fig.2 Effect of different amount of bovine collagen on salt soluble protein content in different storage condition

2.4 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)鹽溶性蛋白凝膠保水性的影響

肉制品蛋白凝膠保水性與鹽溶性蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，鹽溶性蛋白的損失越少，其蛋白質(zhì)的持水能力越高[26]。由圖3可知，在凍藏過(guò)程中，鹽溶性蛋白的凝膠保水力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，在凍融循環(huán)過(guò)程中，隨著溫度波動(dòng)次數(shù)的增加，其保水力下降速度顯著高于固定溫度凍藏，這說(shuō)明溫度波動(dòng)對(duì)鹽溶性蛋白凝膠保水性的能力影響較為顯著[27](P<0.05)。這可能是由于在熱凝膠過(guò)程中，鹽溶性蛋白加熱后結(jié)構(gòu)變松散，其分子間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)封鎖了自由水的流動(dòng)，從而形成較為具有彈性的凝膠產(chǎn)物，而鹽溶性蛋白含量的下降，導(dǎo)致其形成凝膠的能力下降，保水能力降低，這與LIU等[28]和歐陽(yáng)杰等[26]研究結(jié)果相符合，也與本試驗(yàn)前部分對(duì)于鹽溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)研究相符。與空白對(duì)照對(duì)比，加入不同含量的牛皮膠原蛋白后的牛肉餅的凝膠保水性有所上升，且在6%時(shí)最高，最高可達(dá)到34.95%，后續(xù)趨于平緩(P>0.05)，這說(shuō)明在凍藏過(guò)程中，牛皮膠原蛋白可以有效地保護(hù)蛋白質(zhì)的冷凍變性，從而減少鹽溶性蛋白的凝膠保水性的降低[28]。

圖3 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)不同貯藏條件下鹽溶性蛋白凝膠保水性的影響Fig.3 Effect of different amount of bovine collagen on salt-extractable protein water holding capacity in different storage condition

2.5 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)Ca2+-ATPase活性的影響

由于肌球蛋白的結(jié)構(gòu)在凍藏中發(fā)生變性，其位于頭部的Ca2+-ATPase的活性會(huì)發(fā)生顯著下降，所以Ca2+-ATPase是評(píng)價(jià)肌動(dòng)球蛋白分子完整性的良好指標(biāo)[14]。在肌肉中，Ca2+-ATPase的活性越高，蛋白質(zhì)變性程度越小[29]。由圖4可知，冷凍后的牛肉餅的Ca2+-ATPase對(duì)比于新鮮肉組顯著下降(P<0.05)，且在凍融循環(huán)過(guò)程中下降更快，這可能是因?yàn)樵诶鋬龊蜏囟炔▌?dòng)條件下，蛋白質(zhì)結(jié)不斷發(fā)生改變，冷凍變性后蛋白質(zhì)的Ca2+-ATPase活力減弱[29-30]。在加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，Ca2+-ATPase的活力明顯提升，這說(shuō)明牛皮膠原蛋白對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生了明顯的保護(hù)作用；在6%添加量時(shí)Ca2+-ATPase的活力值最高，后續(xù)趨于平穩(wěn)(P>0.05)，說(shuō)明此時(shí)的蛋白質(zhì)性質(zhì)最穩(wěn)定，蛋白質(zhì)變性程度最小，Ca2+-ATPase活性增高，最高可上升25.71%。說(shuō)明牛皮膠原蛋白對(duì)Ca2+-ATPase的活性降低有顯著的效果，這與本試驗(yàn)前部分對(duì)于鹽溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)研究相符。

圖4 牛皮膠原蛋白添加量對(duì)不同貯藏條件下Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of different amount of bovine collagen on Ca2+-ATPase activity in different storage condition

2.6 相關(guān)性分析

試驗(yàn)針對(duì)6%牛皮膠原蛋白添加量下，凍藏和凍融循環(huán)下牛肉餅的解凍損失率(thawing loss rate, Tlr)、pH、色澤(L*,a*,b*)、鹽溶性蛋白溶解量(salt soluble protein content, SSPC)、鹽溶性蛋白凝膠保水性(salt-extractable protein water holding capacity, SepWHC)以及Ca2+-ATPase活力進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示。解凍損失率與b*值(r=0.848，P<0.01)呈極顯著正相關(guān)，與a*值(r=-0.783，P<0.01)和pH值(r=-0.862，P<0.01)、SSPC(r=-0.913，P<0.01)、SepWHC(r=-0.885，P<0.01)和Ca2+-ATPase(r=-0.885，P<0.01)呈極顯著負(fù)相關(guān)[18]；pH值與a*值(r=-0.808，P<0.01)、SSPC(r=0.597，P<0.01)、SepWHC(r=0.546，P<0.01)、Ca2+-ATPase(r=0.864，P<0.01)呈極顯著正相關(guān)[29]，與L*值(r=-0.467，P<0.01)、b*值(r=-0.858，P<0.01)呈極顯著負(fù)相關(guān)；SSPC與SepWHC(r=0.947，P<0.01)呈極顯著正相關(guān)[14]。這說(shuō)明了牛肉在凍藏過(guò)程中，水分的流失導(dǎo)致肌原纖維蛋白出現(xiàn)變性，引起SepWHC、Ca2+-ATPase活力的下降，使其在凍藏過(guò)程中品質(zhì)發(fā)生劣變。

表2 冷凍牛肉餅品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of quality indexes of frozen beef cakes

3 結(jié)論

本文研究了不同添加量的牛皮膠原蛋白在凍藏條件下和凍融循環(huán)條件下的牛肉餅相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)牛皮膠原蛋白可以有效地抑制肉制品中解凍損失率和汁液損失率的上升，減緩蛋白質(zhì)的冷凍變性，提高其凝膠保水能力和Ca2+-ATPase的活力，且6%添加量的牛肉制品相對(duì)于其他添加量對(duì)肉制品的品質(zhì)保持更加顯著。研究結(jié)果表明，牛皮膠原蛋白作為一種綠色高效的抗凍保護(hù)劑，對(duì)調(diào)理牛肉制品中水分和蛋白質(zhì)有良好的保護(hù)能力。本研究為牛皮膠原蛋白作為抗凍劑在冷凍調(diào)理牛肉制中的應(yīng)用提供了一定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。