梁婷,陸奕成,劉彤,管彤,李森

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海，200093)

由于預(yù)期壽命的增加和人口的變化，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐年升高[1]。氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性相關(guān)疾病的主要觸發(fā)因子[2-3]。過量的多不飽和脂肪酸，高有氧率，過渡金屬的存在以及抗氧化酶活性的降低使大腦容易受到氧化損傷[2]。多酚是植物中天然存在的微量營養(yǎng)素，是植物體內(nèi)必需的生理化合物[4]，具有抗氧化、抗炎等特性，已有較多研究證明了多酚的神經(jīng)保護作用[5-7]。

小米是中國北方及西北地區(qū)的傳統(tǒng)谷物之一，富含多酚類物質(zhì)，具有良好的抗氧化性[8]。DYKES等[9]綜述了國內(nèi)外各種小米中所含有的多酚類物質(zhì)，小米中的酚類化合物主要存在于小米的果皮、種皮和糊粉層中，分為兩類：羥基苯甲酸和羥基肉桂酸。根據(jù)國內(nèi)外各種小米品種中酚類化合物成分及含量的相關(guān)研究可知，小米多酚化合物主要為酚酸類和菊花黃酮類[10]。

目前我國對小米的研究還主要集中在其化學成分的分析及營養(yǎng)成分的分析，而對其多酚類活性成分及功效研究較少。延莎等[11]以6種不同米色小米為原料提取小米多酚并探討其多酚提取物的抗氧化性。結(jié)果表明，6種不同米色小米多酚提取物在5種抗氧化實驗中均具有較好的體外抗氧化活性, 且多酚總量與抗氧化性具有顯著相關(guān)性, 所以總酚含量越高，其小米的抗氧化性越好。

本研究對2種產(chǎn)地小米進行了多酚的提取和成分分析，并通過過氧化氫(H2O2)處理 SH-SY5Y 建立神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激模型，探究2種小米多酚對神經(jīng)細胞氧化損傷的保護作用，為深入開發(fā)小米資源進行應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金小米，緣谷緣糧農(nóng)業(yè)科技有限公司；桃花小米，張家口坤記商貿(mào)有限公司；乙醇、石油醚、三氯甲烷、沒食子酸、碳酸鈉(Na2CO3)、Folin-Ciocateu試劑、過氧化氫(H2O2)，國藥化學試劑有限公司(上海)；DMEM-F12培養(yǎng)基、胰酶、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

型號電飯煲，美的集團有限公司；型號凍干機，寧波新芝生物科技股份有限公司；型號高速多功能磨粉機，上海菲力博寶業(yè)公司；200目篩，臺州三門躍陽篩網(wǎng)廠；磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；低溫高速離心機，天美儀拓實驗室設(shè)備(上海)有限公司；型號旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；渦旋振蕩器，美國Scientific Industries公司；紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；色譜儀器，島津LC-30A；質(zhì)譜儀器， AB Sciex Triple TOF 5600+；HH-W-600水浴鍋，金壇市江南儀器廠；BSC-1300IIA2型超凈工作臺，江蘇凈化設(shè)備有限公司；MCO-20AIC型CO2細胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小米多酚提取與純化

將金小米和桃花小米按料液比1∶1.2(g∶mL)煮熟，冷卻至室溫后凍干48 h，用高速多功能磨粉機粉碎機研磨后過200目篩。再將小米粉按料液比1∶10溶于80%(體積分數(shù))乙醇中。在60 ℃恒定攪拌下浸提2 h，得到乙醇提取液。以3 500 r/min 離心10 min后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃，80 r/min濃縮，得到乙醇濃縮液[12]。加入與乙醇濃縮液等體積石油醚萃取，取下層溶液；再加入等體積三氯甲烷萃取，取上層溶液；再加入等體積乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯相合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃，80 r/min濃縮，得乙酸乙酯濃縮液；使用冷凍干燥機凍干48 h得純化小米多酚并在4 ℃下貯存?zhèn)溆肹8]。

1.3.2 總酚含量的測定

采用 Folin-Ciocalteau法測總酚[13]。準確地稱取沒食子酸標準品0.011 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，得到標準液質(zhì)量濃度為0.11 mg/mL。準確吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于25 mL 的棕色試管中，取小米多酚復(fù)溶液0.5 mL，加蒸餾水至6.0 mL，然后分別加入福林酚試劑 0.5 mL，渦旋5 s，8 min后加入1.5 mL 200 g/L的Na2CO3溶液，充分混合后定容，常溫避光放置2 h，以不加標準液的6.0 mL 蒸餾水為空白對照，760 nm下測定吸光值，每個樣品平行測定3次。根據(jù)標準曲線以沒食子酸作為對照樣品計算樣品中總多酚含量。

1.3.3 小米多酚組分分析

取小米復(fù)溶液1 mL于2 mL離心管內(nèi)，放入高速離心機中1 300 r/min離心10 min，過0.22 um微孔濾膜后裝入1.5 mL自動進樣瓶內(nèi)，得到小米提取物樣品。同樣條件得到空白對照樣品。將樣品放入 4 ℃冰箱保存，在分析前取出(保存時間不能超過24 h)。

采用高效液相-色譜分析[14-15]，色譜柱為C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量3 μL；流動相采用乙腈-0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液的梯度洗脫程序，見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

質(zhì)譜離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓分別為5 500 V，離子源溫度為600 ℃，去簇電壓(declustering voltage，DP) 分別為100 V，碰撞能量(collision energy，CE)分別為35 eV，碰撞能量擴展(collision energy expansion，CES)分別為15 eV；離子化模式為電噴霧負離子模式，離子源電壓分別為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，DP分別為100 V， CE分別為-35 eV，CES別為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，信息依賴采集設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的6個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，離子掃描范圍為50～1 000。

1.3.4 SH-SY5Y 神經(jīng)細胞的培養(yǎng)

SH-SY5Y 神經(jīng)細胞在補充有10%胎牛血清(體積分數(shù))的 DMEM-F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在實驗前在 37 ℃下在5%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，用于后續(xù)實驗。

1.3.5 細胞活力的測定

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5- 二苯基四唑溴化物[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]細胞增殖及細胞毒性測試評估小米多酚對 H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷的細胞保護活性[8]。96孔板處理后的SH-SY5Y細胞加入MTT。代謝活躍的細胞將黃色四唑鹽MTT裂解成紫色的甲瓚晶體。將形成的甲瓚溶解，用酶標儀在570 nm 處測量吸光度。結(jié)果以對照組的百分比表示。具體方法以MTT細胞增殖及細胞毒性測定試劑盒生產(chǎn)說明書為依據(jù)。

1.3.6 建立 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型

將生長密度達到90%的 SH-SY5Y 神經(jīng)細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，并按5×103個細胞/孔接種于96孔板中，1個孔加入100 μL細胞，全反式維甲酸(tretinoin，RA)誘導(dǎo)分化48 h。采用H2O2毒性試驗，測定H2O2的IC50值。再通過檢測細胞活性，確定小米多酚對于由H2O2引起的氧化應(yīng)激具有作用的濃度。

1.3.7 小米多酚處理細胞

小米多酚儲備液：金小米和桃花小米濃縮液，添加時根據(jù)多酚含量用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，并過濾除菌。

共處理：小米多酚和H2O2同時加入培養(yǎng)15 h。

預(yù)處理：先用小米多酚與細胞培養(yǎng)12 h后更換H2O2培養(yǎng)15 h。

1.3.8 統(tǒng)計學分析 細胞試驗的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用

使用Graph Pad Prism 8.0.2(graph pad software，San Diego，CA，USA)和SPSS 17.0(IBM corporation，Armonk，NY，USA)進行分析。2組間的差異采用t檢驗進行評估。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米多酚含量比較

以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標建立沒食子酸標準曲線，回歸方程為y=85.28x+0.033 61(R2=0.996 3)，線性范圍0～0.006 16 mg/mL。

根據(jù)標準曲線測得金小米的質(zhì)量濃度為1.23 mg/mL，占總提取物的15.57%，桃花小米的質(zhì)量濃度為1.27 mg/mL，占總提取物的57.26%，桃花小米的酚類含量高于金小米。

2.2 兩種小米多酚的成分分析

本實驗定性檢測出28種多酚類化合物，其中金小米中20種，桃花小米中8種，包含12種黃酮類化合物和其他物質(zhì)，如木質(zhì)素、酚酸、色素、單寧、非黃酮酚類等。與XIANG等[16]測定結(jié)果相似，鑒定出的20種酚類化合物包括黃酮類化合物和酚酸化合物。朱俊玲等[17]也在小米多酚中檢測出黃酮類物質(zhì)。如表2和表3所示，金小米中厚樸三酚、刺苞菊苷、水仙苷、香葉木苷含量較高，桃花小米中厚樸三酚、毛蘭素、5,8-二羥基葛根素、10-姜酚、奎寧酸含量較高。

表2 金小米多酚成分 單位：%

表3 桃花小米多酚成分 單位：%

目前關(guān)于黃酮類(牡荊素、槲皮素等)抗氧化[18]、抗炎[19]、抗血脂[20]、抗癌[21]等研究十分廣泛，刺苞菊苷、染料木苷、水仙苷等研究較少。香葉木苷因其溶解度和生物利用度也鮮有研究[22]，厚樸三酚幾乎沒有相關(guān)研究。

2.3 H2O2的作用濃度及時間

SH-SY5Y 細胞起源于神經(jīng)母細胞瘤，通常被RA誘導(dǎo)分化，以獲得更多神經(jīng)元樣特性，包括神經(jīng)突生長和形態(tài)學改變，以模擬研究中的神經(jīng)元反應(yīng)，促進細胞生存和減少凋亡[23]。對H2O2處理濃度的研究顯示，當利用 300 μmol/L H2O2處理 SH- SY5Y 15 h 后，SH-SY5Y 的細胞活力顯著下降到對照組的50%(圖1)。

a-H2O2作用5 h；b-H2O2作用10 h；c-H2O2作用15 h圖1 不同時間和H2O2作用濃度對細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different time and concentration of H2O2 on cell viability

2.4 小米多酚神經(jīng)保護作用

用不同質(zhì)量濃度(100、200、300、400、500、600 μg/mL)的小米多酚對 SH-SY5Y 細胞進行處理，對照組為不經(jīng)H2O2和小米多酚處理的正常培養(yǎng)細胞，細胞存活率記100%。分別評價小米多酚預(yù)處理和共處理對神經(jīng)細胞的保護作用，共處理的方式為SH-SY5Y在RA誘導(dǎo)48 h后小米多酚和H2O2同時加入培養(yǎng)15 h，預(yù)處理則是SH-SY5Y在RA誘導(dǎo)48 h后先用小米多酚與細胞培養(yǎng)12 h后更換H2O2培養(yǎng)15 h。

結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，H2O2處理(100 μmol/L)組細胞生存力顯著受到損傷。由圖2-a和圖2-c可以看出，共處理的方式下，小米多酚對于神經(jīng)細胞的保護作用并不顯著。圖2-b和圖2-d中，小米多酚預(yù)處理下，200～300 μg/mL的小米多酚對 H2O2損傷的SH-SY5Y具有保護作用(P<0.05)。而當小米多酚質(zhì)量濃度增加到400 μg/mL以上時，細胞生存力反而下降，這可能是由于多酚類物質(zhì)在高濃度下對細胞產(chǎn)生了毒性作用。不論是金小米還是桃花小米，預(yù)處理方式下細胞的生存率總是優(yōu)于共處理，吳枝娟等[24]在阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細胞損傷的研究中FA預(yù)處理組細胞生存率均高于相同劑量FA共處理組，這與本研究相一致。推測這其中的原因可能是預(yù)處理的方式使細胞活力增強，增殖更多從而提高了細胞的抵御能力。

a-金小米與H2O2共處理；b-金小米預(yù)處理；c-桃花小米與H2O2共處理；d-桃花小米預(yù)處理圖2 小米多酚對H2O2處理的SH-SY5Y細胞生存力的影響Fig.2 Effects of millet polyphenol on the viability of SH-SY5Y cells treated with H2O2注：*表示P<0.05；**表示P<0.01

雖然金小米的總酚含量較低，但是金小米中酚的種類較多且含有像荊素、維生素E、白藜蘆醇、槲皮素、FA等抗氧化及自由基清除能力較強的酚類[25]，牡荊素可通過激活PI3K/Akt信號通路保護多巴胺能神經(jīng)元免受MPP+/mptp誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[26]。白藜蘆醇通過抑制NF-κB信號通路對Aβ42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞炎癥的抑制作用[27]。而桃花小米中酚類種類較少，且其生物活性不如金小米中的酚類。

3 結(jié)論

通過對金小米和桃花小米總酚提取及含量檢測，發(fā)現(xiàn)桃花小米酚類含量更高，但金小米中酚類化合物種類較多。2種小米的多酚中厚樸三酚含量最高，但是目前幾乎沒有關(guān)于厚樸三酚的研究，作為小米多酚中重要的成分，其研究價值不應(yīng)被忽略。H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激模型顯示2種小米多酚濃度在 200～300 μg/mL 內(nèi)都可以提高H2O2處理的SH-SY5Y細胞的存活率，證明小米多酚對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)細胞具有一定的保護作用。小米多酚預(yù)處理的保護作用優(yōu)于共處理，其具體原因值得進一步研究。