李曉晨，王進(jìn)，徐晨晨，肖葉，李燕,2,3，盧瑛,2,3*，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品及加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)

奶酪作為發(fā)酵型乳制品蘊(yùn)藏豐富具有益生特性的乳酸菌。據(jù)報(bào)道[1]微生物發(fā)酵法能夠降解食物中的過(guò)敏原，并且利用不同的菌種(乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌)對(duì)食物蛋白進(jìn)行發(fā)酵，其過(guò)敏原降解的程度也有所不同。FRIAS等[2]利用植物乳桿菌發(fā)酵豆粕48 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示豆粕中的致敏蛋白被全部降解，ELISA結(jié)果顯示免疫球蛋白E結(jié)合能力降低了96%以上。肖葉等[3]利用植物乳桿菌水解對(duì)蝦中的原肌球蛋白得到了類(lèi)似的結(jié)果。此外，酪蛋白或脫脂牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后能夠使β-酪蛋白[4]、β-乳球蛋白[5]顯著降解，且免疫活性下降。根據(jù)上述應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠降低牛乳，大豆，蝦類(lèi)過(guò)敏原的免疫活性，具有效果顯著、安全性高、特異性強(qiáng)和應(yīng)用價(jià)值高等優(yōu)勢(shì)，但利用乳酸菌消減魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原鮮有研究。

魚(yú)類(lèi)是引起食物過(guò)敏的常見(jiàn)水產(chǎn)品之一，其中淡水魚(yú)相比海水魚(yú)更易致敏[6]。據(jù)顯示，人們對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)主要是由小清蛋白(parvalbumin，PV)引起的[7]。其分子質(zhì)量約為10～14 kDa，具有極高的熱穩(wěn)定性。KUBOTA等[8]研究表明使用140 ℃ 以上的高溫處理魚(yú)組織，才能使PV的免疫活性下降。

因此，本研究通過(guò)分離奶酪中的乳酸菌，利用脫脂牛乳平板透明圈法作為產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的初步篩選標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定。通過(guò)提取草魚(yú)中的PV與篩選的乳酸菌進(jìn)行孵育，評(píng)價(jià)孵育過(guò)程中PV含量和免疫活性的變化，篩選有效降低PV免疫活性的乳酸菌，以期為乳酸菌發(fā)酵魚(yú)肉開(kāi)發(fā)低致敏性魚(yú)肉制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶酪，新疆烏魯木齊王家梁農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；新鮮草魚(yú)，上海市浦東新區(qū)蘆潮港。

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司；預(yù)染和非預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)記物、BCA蛋白定量試劑盒，北京天根生化科技有限公司；小清蛋白單克隆抗體EG8，實(shí)驗(yàn)室自制；R-250考馬斯亮藍(lán)染色液、2×上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉、Tris分析純，上海生工生物工程有限公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)(0.45 μm)，美國(guó)Millipore公司；脫脂奶粉，美國(guó)BD公司；DAB顯色液(D0426-50SET)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-100S11立式壓力蒸氣滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-ZF可調(diào)式垂直單向潔凈工作臺(tái)，上海天恒醫(yī)療器械有限公司；JA1003電子天平，常州市宏恒電子儀器廠；ZQWY-200振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；TS-8脫色搖床，江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀，德國(guó) Hermle 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離篩選

無(wú)菌條件稱(chēng)取25.0 g奶酪放入含225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器制成樣品勻液，進(jìn)行10倍梯度稀釋并涂布MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[9]。觀察菌落生長(zhǎng)情況(顏色、形狀、隆起、邊緣等)，挑取特征菌落于MRS平板劃線獲得單菌落純培養(yǎng)物。通過(guò)過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、生理生化鑒定篩選目的菌。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選

參照胡玲萍等[10]的方法略作修改，將菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)24 h，菌液離心(8 000 r/min，10 min)取50 μL上清液添加至脫脂牛乳瓊脂平板孔內(nèi)，37 ℃放置過(guò)夜，觀察平板上產(chǎn)生的透明圈并測(cè)量記錄。每個(gè)菌株進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

參考郭艷榮等[11]的方法，將MRS培養(yǎng)18 h菌液離心收集菌體(8 000 r/min，15 min)，用DNA快速抽提試劑盒提取DNA，使用16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用BioEdit 7.0軟件拼接序列，于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank中與已知菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)[11-12]尋找同源性最高的菌種。使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法對(duì)8株乳酸菌作系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[13]。

1.3.5 草魚(yú)PV的提取與富集

參照Z(yǔ)HANG等[14]的方法略作修改，新鮮草魚(yú)取白色肌肉200 g，加入5倍體積的抽提液進(jìn)行勻漿，離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)取上清液加入三氯乙酸(trichloroacetic acid solution，TCA)溶液，冰浴攪拌10 min，調(diào)節(jié)pH至5.2，繼續(xù)攪拌1 h。離心取上清液再次加入TCA溶液，攪拌10 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，20 min)收集沉淀并加入少量去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH至中性。所得溶液透析24 h后進(jìn)行冷凍干燥。采用SDS-PAGE和蛋白免疫印跡(Western blot)對(duì)提取的PV進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5.1 SDS-PAGE

參照Z(yǔ)HANG等[14]的方法，濃縮膠和分離膠濃度分別為4%和14%，樣品上樣量為8 μL。

1.3.5.2 Western blot

參照SONG等[15]的方法略作修改。用半干式碳板轉(zhuǎn)印儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，條件為恒流180 mA，20 min。用封閉液覆蓋于PVDF膜，室溫封閉1 h。用含有0.05% 吐溫-20磷酸緩沖液(phosphate buffered saline-tween 20,PBST)洗滌。單克隆抗體EG8(體積比1∶10 000)作為一抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌。HRP-羊抗小鼠IgG(體積比1∶2 500)作為二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌。DAB顯色液顯色后拍照保存。

1.3.6 乳酸菌和PV溶液的孵育反應(yīng)

參照PESCUMA等[16]的方法略作修改，將8株乳酸菌分別接入MRS液體培養(yǎng)基活化2次，菌液10 000 r/min離心，用PBS洗滌菌體3次，將菌體懸浮于PBS，濃度為1×108CFU/mL。按體積比1∶1加入2 mg/mL PV蛋白溶液于恒溫?fù)u床37 ℃，200 r/min孵育24 h。對(duì)照為未加菌體的PV溶液。孵育結(jié)束后離心(8 000 r/min，10 min)收集上清液，采用SDS-PAGE分析PV含量的變化。

1.3.7 孵育時(shí)間對(duì)PV含量和免疫活性的影響

菌株活化及處理參照1.3.6方法進(jìn)行。孵育時(shí)間梯度設(shè)為18、20、22、24、26、36 h。孵育后離心收集上清液用SDS-PAGE分析PV含量的變化，采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA評(píng)價(jià)PV免疫活性的變化。

1.3.8 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA

參照丁婕等[17]的方法。PV用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至5 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次15 s。加入封閉液于37 ℃封閉2 h，PBST洗滌。每孔加入預(yù)先與EG8孵育1 h的樣品100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌。加入HRP-羊抗小鼠免疫球蛋白G(體積比1∶2 500)100 μL，37 ℃ 孵育 1 h，洗滌后加入鄰苯二胺底物顯色液100 μL，顯色后加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD值)。以碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)作為陰性對(duì)照，以抗體稀釋液稀釋的EG8作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)平行。樣品中PV免疫活性的消減率的計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：陽(yáng)性O(shè)D450為陽(yáng)性對(duì)照孔的OD值；樣品OD450為樣品孔的OD值；陰性O(shè)D450為陰性對(duì)照孔的 OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，由SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，由Origin 2018 64 Bit軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)特征、生理生化特性和產(chǎn)蛋白酶能力

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和部分生理生化試驗(yàn)，從奶酪中分離篩選出45株分離株，進(jìn)一步利用透明圈法篩選得到8株符合乳酸菌特征的產(chǎn)蛋白酶菌株，編號(hào)標(biāo)記為A-5～B-19，其菌落形態(tài)特征及部分生理生化特性如表1所示，產(chǎn)透明圈大小見(jiàn)表2。

表1 菌株的形態(tài)特征及生理生化特性Table 1 Morphological and biochemical characteristics of the strain

表2 菌株產(chǎn)透明圈大小情況Table 2 The size of the clear zone produced by the strains

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

提取8株分離株的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖1所示，8株待測(cè)菌株在約1 500 bp處條帶清晰明亮，無(wú)雜帶，表明PCR擴(kuò)增成功，能滿足后續(xù)菌株16S rDNA序列的測(cè)定。

1～8-A-5～B-19；9-陰性對(duì)照?qǐng)D1 16S rDNA PCR 擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA amplification products

測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中的BLAST進(jìn)行序列相似性比對(duì)，將8株分離株鑒定為乳酸菌的2個(gè)屬，3個(gè)種。利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖2。Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis、Lactobacilluscasei、Enterococcusfaecium各自聚為一類(lèi)。其中A-5、A-9、B-14和B-17與LactobacillusplantarumIDCC 3502，LactobacillusplantarumMG5211在同一分支，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillusplantarum；B-2和A-16與LactobacilluscaseiM8，LactobacilluscaseiMT.ZH493聚為一類(lèi)，且序列同源性達(dá)100%，因此將其鑒定為L(zhǎng)actobacilluscasei；B-6，B-19和EnterococcusfaeciumIDCC 2103同源性達(dá)到100%，故鑒定其為Enterococcusfaecium。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strains

2.3 PV的提取與富集

草魚(yú)肌肉提取液和TCA處理樣品的電泳分析結(jié)果如圖3所示。SDS-PAGE的14.4 kDa附近有2個(gè)蛋白質(zhì)條帶(圖3-a)，其分子質(zhì)量與報(bào)道的PV分子質(zhì)量接近[7,18]。此外，免疫印跡結(jié)果顯示11 kDa附近的條帶與EG8單抗有特異性反應(yīng)，因EG8單抗對(duì)魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原PV有特異性反應(yīng)[19]，故該條帶被鑒定為草魚(yú)的PV。對(duì)比TCA處理前后的電泳條帶，發(fā)現(xiàn)第2次TCA處理后的樣品條帶(圖3-a)顯著變粗，表明2次TCA處理可以有效富集草魚(yú)中的PV，且含量較多，純度較高。

M-蛋白Marker；1-粗蛋白上清液；2-粗蛋白沉淀；3-1次TCA沉淀；4-2次TCA沉淀透析后樣品a-SDS-PAGE；b-Western blot圖3 草魚(yú)PV提取過(guò)程樣品的SDS-PAGE和Western blotFig.3 SDS-PAGE and Western blot of PV extract samples of Ctenopharyngodon idella

2.4 乳酸菌對(duì)草魚(yú)PV的降解性能分析

圖4中1～8依次為菌株A-5～B-19與PV孵育24 h的樣品條帶。由圖4可知，LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17孵育PV 24 h后，PV條帶發(fā)生了明顯的變化。經(jīng)LactobacilluscaseiB-2孵育后位于14.4 kDa左右的條帶消失，而在14.4 kDa下方出現(xiàn)了新的條帶，顏色變淺且出現(xiàn)多個(gè)條帶，最下方的條帶與對(duì)照樣品相比明顯變細(xì)，表明PV經(jīng)這2株乳酸菌處理后發(fā)生了部分降解。經(jīng)菌株LactobacillusplantarumB-17孵育后的PV條帶顏色顯著變淺，說(shuō)明PV含量明顯減少。其他菌株對(duì)PV條帶無(wú)較大影響，因此挑選LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17進(jìn)一步研究孵育時(shí)間對(duì)PV含量和免疫活性的影響。

M-蛋白Marker；C-PV對(duì)照；1～8-菌株A-5～B-19孵育PV樣品圖4 PV孵育24 h的 SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of PV incubation for 24 h

2.5 孵育時(shí)間對(duì)降低PV含量和免疫活性的影響

LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17對(duì)PV溶液不同孵育時(shí)間的電泳分析結(jié)果如圖5所示，這2株菌孵育36 h的PV條帶相對(duì)于對(duì)照樣品幾乎不可見(jiàn)，表明此時(shí)PV蛋白質(zhì)基本被全部降解了。而LactobacilluscaseiB-2與PV孵育的18～24 h間PV含量無(wú)明顯變化，26 h時(shí)14.4 kDa上方的條帶消失，而在下方出現(xiàn)新條帶，位于12 kDa左右的條帶明顯變窄，顏色變淺，可見(jiàn)PV出現(xiàn)了部分降解。

M-蛋白Marker；C-PV對(duì)照a-B-2；b-B-17圖5 孵育PV后的含量變化Fig.5 Changes in the content of PV after incubation

LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17孵育PV后，通過(guò)計(jì)算消減率表示不同時(shí)間段PV免疫活性的變化情況。消減率越高說(shuō)明對(duì)PV免疫活性的消減效果越好，反之亦然。結(jié)果如圖6所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，消減率逐步增加。反應(yīng)36 h 時(shí)，LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17對(duì)PV免疫活性消減率最高，分別為96.5% 和84.8%。

圖6 B-2、B-17孵育PV的免疫活性變化Fig.6 changes of PV Antigenicity treated by B-2 and B-17 strains注：組間不同小寫(xiě)字母代表存在顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道乳酸菌有1個(gè)高效的蛋白水解系統(tǒng)，由1個(gè)細(xì)胞膜蛋白酶(啟動(dòng)蛋白質(zhì)降解)、1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和幾個(gè)胞內(nèi)肽酶組成[20-21]，且不同乳酸菌菌株對(duì)不同種類(lèi)的過(guò)敏原蛋白具有不同的水解效果[22]。本研究從奶酪中篩選獲得8株產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌，其產(chǎn)透明圈大小顯示了一定的差異性，說(shuō)明具有不同的分解牛乳蛋白的能力，透明圈越大，分解牛乳蛋白的能力則越強(qiáng)，產(chǎn)生的蛋白酶活性越高。其中LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17產(chǎn)透明圈平均值為5.83、5.16 mm，與PV溶液孵育36 h使PV顯著降解，且免疫活性分別降低96.5% 和84.8%。雖然EnterococcusfaecalisB-6，LactobacillusplantarumA-5 顯示了相似甚至更好的產(chǎn)蛋白酶能力，但對(duì)PV幾乎無(wú)影響。相關(guān)研究[23]發(fā)現(xiàn)L.delbrueckiisubsp.bulgaricus92059水解β-酪蛋白24 h時(shí)蛋白完全降解，而L.helveticus92201對(duì)β-酪蛋白的水解效果并不明顯。說(shuō)明不同的乳酸菌菌株對(duì)致敏蛋白的降解效果不同，在本研究中也得到了類(lèi)似的結(jié)果。LAW等[24]研究指出乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶將乳蛋白裂解成多肽，多肽酶將多肽裂解成更小的多肽和氨基酸，從而抗原表位可能被裂解。因此，我們推測(cè)孵育過(guò)程中PV發(fā)生降解是由于LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17產(chǎn)生蛋白酶將PV水解為多肽，進(jìn)而引起PV免疫活性下降。

目前，乳酸菌發(fā)酵法降解食物中的過(guò)敏原多研究報(bào)道于牛乳和大豆制品，在降解過(guò)敏原的同時(shí)還能產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，贏得廣大消費(fèi)者的青睞。因此，利用乳酸菌發(fā)酵魚(yú)肉制品具有良好的應(yīng)用前景，以期在降解過(guò)敏原的同時(shí)提升產(chǎn)品風(fēng)味和口感。本研究篩選到的LactobacilluscaseiB-2和LactobacillusplantarumB-17 能夠顯著降低PV的免疫活性，從而顯示出了降低PV致敏性的潛力，今后可進(jìn)一步探究不同發(fā)酵條件對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)和風(fēng)味的影響，將乳酸菌發(fā)酵應(yīng)用于低致敏性魚(yú)類(lèi)制品的開(kāi)發(fā)。