曾 潔，曾友玲，張 清，陳 說，楊 玉，馬元學(xué)

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，病死率居婦科腫瘤首位，其發(fā)病率近年來呈現(xiàn)上升趨勢[1]。卵巢癌的治療方式主要包括外科手術(shù)治療和化療，醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步盡管改善了卵巢癌患者的預(yù)后，但其五年生存率依然很低，嚴(yán)重威脅女性生命健康[2]。因此，尋找新的卵巢癌早期診斷標(biāo)志物和分子治療靶標(biāo)對改善患者的預(yù)后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[3]。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平影響基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、衰老等各種生物學(xué)行為[4]。越來越多的研究[5]表明，lncRNA在多種腫瘤如卵巢癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、肝癌等中表達(dá)異常，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。研究[6- 7]顯示，lncRNA PITPNA-AS1定位于細(xì)胞質(zhì)，可影響肝癌、肺癌、宮頸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移、凋亡等。卵巢癌中關(guān)于PITPNA-AS1的報道很少。該研究通過檢測卵巢癌組織和細(xì)胞系中PITPNA-AS1的表達(dá)水平，觀察過表達(dá)PITPNA-AS1后卵巢癌細(xì)胞增殖活力和侵襲能力，并進(jìn)一步預(yù)測和驗(yàn)證PITPNA-AS1作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本 收集2018年6月—2020年8月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)婦科接受手術(shù)治療的42例卵巢癌患者的癌組織和癌旁組織?；颊吣挲g38～74(56.42±9.13)歲。組織于液氮罐中保存，所有組織均由該院病理科醫(yī)師確認(rèn)，癌組織類型均為漿液性囊腺癌，高分化19例，中低分化23例。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期為Ⅰ期+Ⅱ期28例、Ⅲ期+Ⅳ期14例。該研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑人卵巢癌細(xì)胞系(HO-8910、A2780、SKOV-3、OVCAR-3、OC3)和正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。miR-92a-3p mimics、miR-NC、PITPNA-AS1過表達(dá)質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒、PITPNA-AS1-WildType-Reporter(WT)載體、PITPNA-AS1-Mut-Reporter(Mut)載體、TCF21-WildType-Reporter(WT)載體、TCF21-Mut-Reporter(Mut)載體購自上海吉瑪公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自美國康寧公司。TRIzol試劑盒、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠購自美國Invitrogen公司。細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)(cell count kit-8，CCK-8)試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。qPCR試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Roche公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒和一抗(TCF21、CDK6、β-Tubulin、Cyclin D2、Zeb2、Snail)均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 常規(guī)復(fù)蘇OVCAR-3、OC3細(xì)胞后培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，常規(guī)復(fù)蘇HO-8910、A2780、SKOV-3、IOSE80細(xì)胞后培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的OVCAR-3細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞匯合度為50%時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將PITPNA-AS1或陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)OVCAR-3細(xì)胞，記為實(shí)驗(yàn)組和對照組，轉(zhuǎn)染方法依據(jù)Lipofectamine 3000說明書嚴(yán)格操作。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2熒光實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) 采用TRIzol法提取組織或細(xì)胞中總RNA，超微量分光光度計檢測RNA的純度及濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。建立qPCR擴(kuò)增體系，qPCR引物序列：PITPNA-AS1上游引物為 5′-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3′，下游引物為5′-CCTACTGACAGGATGTCCT-3′；GAPDH上游引物為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；TCF21上游引物為 5′-TCCTGGCTAACGACAAATACGA-3′，下游引物為5′-TTTCCCGGCCACCATAAAGG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-92a-3p上游引物為 5′-UAUUGCACUGUCCCGGCCUGU-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，以GAPDH為內(nèi)參分析PITPNA-AS1和TCF21 mRNA的表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參分析miR-92a-3p的表達(dá)水平。

1.2.3CCK-8檢測OVCAR-3細(xì)胞的增殖活性 將轉(zhuǎn)染后的各組OVCAR-3細(xì)胞接種于96孔板(3 000個/孔)，200 μl/孔培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，在每個時間點(diǎn)分別進(jìn)行CCK-8法檢測時，每孔中加入20 μl CCK-8試劑，在暗箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處每孔的吸光度(A)值，以A值代表細(xì)胞的增殖活性。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測OVCAR-3細(xì)胞的侵襲能力 預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠至Transwell小室上層，在培養(yǎng)箱中凝固。胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后的OVCAR-3細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室上層(2×104個/孔)，每孔200 μl培養(yǎng)基。在Transwell小室下層加600 μl含血清培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。流水沖洗后，采用棉簽擦去未穿膜的OVCAR-3細(xì)胞。室溫下風(fēng)干后，在光學(xué)顯微鏡下對侵襲細(xì)胞數(shù)計數(shù)。

1.2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測PITPNA-AS1作用的分子機(jī)制 使用starBase v2.0網(wǎng)站預(yù)測PITPNA-AS1可相互作用的微小RNA(miRNA)。使用DIANA-microT網(wǎng)站預(yù)測miRNA的靶基因。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 將PITPNA-AS1-WT、PITPNA-AS1-Mut質(zhì)粒分別與miR-NC、miR-92a-3p共轉(zhuǎn)染至OVCAR-3細(xì)胞中，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作，48 h后用化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定每組細(xì)胞的相對熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-92a-3p靶向結(jié)合并受PITPNA-AS1調(diào)控。將TCF21-WT、TCF21-Mut質(zhì)粒分別與miR-92a-3p、miR-NC共轉(zhuǎn)染至OVCAR-3細(xì)胞中，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作，48 h后用化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定每組細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-92a-3p靶向結(jié)合并可調(diào)控TCF21。

1.2.7Western blot檢測 在各組細(xì)胞中加入1 ml RIPA 裂解液，冰上裂解 30 min，收集上清液并采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。每孔道加等量蛋白，進(jìn)行十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉3 h，加入均以1 ∶1 000比例稀釋的一抗，在冰箱內(nèi)孵育過夜。加入以1 ∶10 000比例稀釋的二抗孵育3 h，滴加ECL溶液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)內(nèi)顯影、拍照，以β-tubulin為內(nèi)參蛋白。采用Image-Pro Plus 4.0軟件比較蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 PITPNA-AS1在卵巢癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)該研究結(jié)果顯示，PITPNA-AS1在卵巢癌組織相對表達(dá)低于癌旁組織相對表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.81，P<0.01)，見圖1。與正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞相比，PITPNA-AS1在人卵巢癌細(xì)胞系(HO-8910、A2780、SKOV-3、OVCAR-3、OC3)中低表達(dá)(P<0.05)，見圖2，以O(shè)VCAR-3細(xì)胞中PITPNA-AS1的表達(dá)最低(P<0.01)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選該細(xì)胞系。

圖1 PITPNA-AS1在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)與癌旁組織比較：**P<0.01

圖2 PITPNA-AS1在正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)與IOSE80細(xì)胞比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 轉(zhuǎn)染PITPNA-AS1過表達(dá)質(zhì)粒對OVCAR-3細(xì)胞中PITPNA-AS1的表達(dá)的影響該研究顯示，PITPNA-AS1在對照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞中相對表達(dá)分別為(1.01±0.07)和(12.12±2.54)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示PITPNA-AS1質(zhì)粒可有效提高OVCAR-3細(xì)胞中PITPNA-AS1的表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 過表達(dá)PITPNA-AS1對OVCAR-3細(xì)胞增殖活性的影響CCK-8法檢測顯示(圖3)，接種2 d后，對照組OVCAR-3細(xì)胞吸光度高于實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞(P<0.05)，表明過表達(dá)PITPNA-AS1能抑制OVCAR-3細(xì)胞增殖活性。

圖3 過表達(dá)PITPNA-AS1對OVCAR-3細(xì)胞增殖活性的影響與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 過表達(dá)PITPNA-AS1對OVCAR-3細(xì)胞的侵襲能力影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示(圖4)，對照組穿膜細(xì)胞數(shù)個/視野多于實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明過表達(dá)PITPNA-AS1能抑制OVCAR-3細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 過表達(dá)PITPNA-AS1表達(dá)對OVCAR-3細(xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)晶紫染色 ×100與對照組比較：**P<0.01

2.5 生物信息學(xué)方法預(yù)測PITPNA-AS1作用的分子機(jī)制如圖5，使用starBase v2.0網(wǎng)站預(yù)測顯示，miR-92a-3p可以與PITPNA-AS1的互補(bǔ)序列結(jié)合。使用DIANA-microT網(wǎng)站預(yù)測顯示，TCF21 mRNA可以與miR-92a-3p中互補(bǔ)序列結(jié)合。

圖5 PITPNA-AS1互補(bǔ)結(jié)合miR-92a-3p的序列區(qū)域及miR-92a-3p互補(bǔ)結(jié)合TCF21 mRNA的序列區(qū)域

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)如圖6，共轉(zhuǎn)染PITPNA-AS1-WT與miR-92a-3p后相對熒光素酶強(qiáng)度較PITPNA-AS1-WT與miR-NC降低(P<0.01)，定點(diǎn)突變后，共轉(zhuǎn)染PITPNA-AS1-Mut與miR-92a-3p較PITPNA-AS1-Mut與miR-NC相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明PITPNA-AS1能夠靶向結(jié)合miR-92a-3p。如圖6，共轉(zhuǎn)染TCF21-WT與miR-92a-3p后相對熒光素酶強(qiáng)度較TCF21-WT與miR-NC降低(P<0.01)，定點(diǎn)突變后，共轉(zhuǎn)染TCF21-Mut與miR-92a-3p較TCF21-Mut與miR-NC相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明TCF21能夠靶向結(jié)合miR-92a-3p。

圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PITPNA-AS1作用的分子機(jī)制A：PITPNA-AS1與miR-92a-3p的靶向關(guān)系驗(yàn)證；B：miR-92a-3p與TCF21的靶向關(guān)系驗(yàn)證;與miR-NC比較：**P<0.01

2.7 過表達(dá)PITPNA-AS1的OVCAR-3細(xì)胞中miR-92a-3p和TCF21 mRNA的表達(dá)情況本研究顯示，對照組OVCAR-3細(xì)胞中miR-92a-3p相對表達(dá)(1.02±0.10)高于實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)(0.35±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；對照組OVCAR-3細(xì)胞中TCF21 mRNA相對表達(dá)(1.09±0.24)低于實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)(6.79±1.31)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明過表達(dá)PITPNA-AS1能下調(diào)miR-92a-3p的表達(dá)，增加TCF21 mRNA的表達(dá)。

2.8 過表達(dá)PITPNA-AS1的OVCAR-3細(xì)胞中TCF21蛋白的表達(dá)該研究采用Western blot檢測結(jié)果顯示(圖7)，過表達(dá)PITPNA-AS1后，TCF21蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK6、Cyclin D2表達(dá)降低，細(xì)胞侵襲相關(guān)Zeb2、Snail表達(dá)降低，間接表明卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲被抑制。

圖7 過表達(dá)PITPNA-AS1對OVCAR-3細(xì)胞TCF21蛋白表達(dá)的影響與對照組比較：**P<0.01

3 討論

lncRNA在細(xì)胞中廣泛存在，參與調(diào)控各種信號通路，lncRNA的異常表達(dá)與心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。TPT1-AS1[3]、FAM83H-AS1[5]、KCNQ1OT1[8]等lncRNA已被研究證實(shí)可影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。Ren et al[7]研究發(fā)現(xiàn)，PITPNA-AS1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，沉默PITPNA-AS1可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同一個lncRNA在不同的腫瘤中可發(fā)揮不同的作用，既可表現(xiàn)為癌基因作用，也可表現(xiàn)為抑癌基因作用[9]。PITPNA-AS1在卵巢癌中的表達(dá)和功能尚不明確。該研究結(jié)果表明，與癌旁組織和正常卵巢上皮細(xì)胞系比較，PITPNA-AS1在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)降低，提示PITPNA-AS1可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。該研究通過CCK-8、Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PITPNA-AS1對卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖和侵襲具有抑制作用，提示PITPNA-AS1在卵巢癌中表現(xiàn)為抑癌基因作用。

微小RNA(miRNA)是一類長度約為18～24個核苷酸的小分子單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平特異性結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或者直接抑制其翻譯[10]。lncRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA促進(jìn)靶基因mRNA的表達(dá)，lncRNA-miRNA-靶基因mRNA是lncRNA發(fā)揮功能的重要機(jī)制[9]。該研究采用starBase v2.0網(wǎng)站預(yù)測顯示，PITPNA-AS1可能互補(bǔ)結(jié)合miR-92a-3p。miR-92a-3p是miRNA家族一員。Li et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，miR-92a-3p可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡，miR-92a-3p表現(xiàn)為癌基因作用。與正常組織相比，miR-92a-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)較高[12]。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示PITPNA-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-92a-3p。過表達(dá)PITPNA-AS1后，miR-92a-3p表達(dá)降低，提示PITPNA-AS1可能在卵巢癌細(xì)胞中競爭性結(jié)合miR-92a-3p。

該研究采用DIANA-microT網(wǎng)站預(yù)測顯示，miR-92a-3p可能互補(bǔ)結(jié)合TCF21 mRNA。TCF21基因定位于染色體6q23-q24，是一種新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[13]。TCF21蛋白屬于基本螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族，研究表明TCF21在卵巢癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中低表達(dá)，過表達(dá)TCF21可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14-15]。該研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-92a-3p可互補(bǔ)結(jié)合TCF21 mRNA。miR-92a-3p表達(dá)下調(diào)后，TCF21基因的表達(dá)增加，提示miR-92a-3p在卵巢癌細(xì)胞中的靶基因是TCF21。TCF21蛋白表達(dá)增加后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK6、Cyclin D2表達(dá)降低，細(xì)胞侵襲相關(guān)Zeb2、Snail表達(dá)降低，間接提示卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲被抑制。

綜上所述，PITPNA-AS1在卵巢癌組織及細(xì)胞系中低表達(dá)，上調(diào)PITPNA-AS1通過競爭性結(jié)合miR-92a-3p，增加TCF21基因的表達(dá)，從而抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力，PITPNA-AS1可能是卵巢癌潛在的診療靶標(biāo)。