李 靖，謝 波，汪 虎，張晨嵩，賈建光，潘成武，馬家馳

胃癌(gastric carcinoma, GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率排名第五，病死率排名第三[1]。雖然手術(shù)治療、放療和化療已被應(yīng)用于胃癌的治療，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%[2]。基因重組是癌癥的一個(gè)標(biāo)志，可導(dǎo)致具有致癌特性的基因融合[3]。近年來研究[4]表明，胃癌中有CLDN18-ARHGAP26融合基因。表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合期的胃癌細(xì)胞系上皮表型明顯減少，出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，從而對(duì)目前主要的胃癌化療相關(guān)藥物耐藥。研究[5]表明，人參皂苷可以有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，在低濃度奧沙利鉑(oxaliplatin, L-OHP)細(xì)胞模型中人參皂苷可以顯著提高低濃度的奧沙利鉑對(duì)胃癌側(cè)群(side population, SP)細(xì)胞的敏感性，而在耐奧沙利鉑胃癌EMT模型中，人參皂苷可以有效逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞株EMT，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。該研究中利用人參皂苷干預(yù)探究人參皂苷在CLDN18-ARHGAP26融合突變引起的耐化療藥過程中的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料人胃癌細(xì)胞系BGC-823購自南京科佰生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購美國Hyclone公司；過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的慢病毒載體由上海吉瑪基因公司構(gòu)建；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo公司；TRIzol試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；E-Cadherin、Vimentin抗體均購自美國Abcam公司；RAPI裂解液和BCA法蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑購自美國羅氏公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液均購自美國Millipore公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Hoechst33342染液購自美國Sigma公司。BD FACSMelody細(xì)胞分選儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系BGC-823用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞長到70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA消化進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分選選擇生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶-EDTA消化，取適量細(xì)胞懸液收集細(xì)胞1 000 r/min，4 ℃，離心5 min，用含2%FBS的PBS液洗滌2次。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml細(xì)胞，加入終濃度為5 μg/ml Hoechst33342染液放置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱箱中孵育2 h，孵育結(jié)束后，細(xì)胞用含2%FBS的PBS清洗一次終止反應(yīng)。最后使用BD FACSMelody細(xì)胞分選儀進(jìn)行SP和NSP細(xì)胞的檢測及分選(355 nm波長紫外光激發(fā)Hoechst染色，于450 nm收集藍(lán)光熒光信號(hào)，650 nm收集紅光熒光信號(hào))。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823NSP細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，取2 ml/孔接種于6孔板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，第二天，用含有5 μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基加入適量病毒懸液替換原培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。Control組加入對(duì)照慢病毒，Lentivirus組加入過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的慢病毒。培養(yǎng)12 h后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測步驟。

1.5 總RNA提取和qPCR將轉(zhuǎn)染CLDN18-ARHGAP26融合突變基因48 h的NSP細(xì)胞培養(yǎng)基倒掉，用無菌PBS洗滌2次，再加入1 ml的TRIzol裂解液室溫裂解5 min后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，取200 μl三氯甲烷加入裂解液中充分混勻后靜置15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層透明的水相并加入等體積的異丙醇后混勻，室溫靜置10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，所得到的白色沉淀即為細(xì)胞總RNA，用75%乙醇將沉淀洗2次，用適量的水將RNA溶解。用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

設(shè)計(jì)合成CLDN18-ARHGAP26引物，F(xiàn)：5′-TGGG TCCAACACCAAAAACAAG-3′，R：5′-GAGTCTGTTTT CCGCCGTGT-3′；ABCG2引物，F(xiàn)：5′-TTTACGCACAG AGCAAAGCC-3′，R：5′-GTCAGCGTGGGATCCTCTT C-3′；內(nèi)參GAPDH引物，F(xiàn)：5′-TCAGCCGCATCTTC TTTTGC-3′，R：5′-ATGGTGTCTGAGCGATGTGG-3′。以cDNA作為模板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物用ABI SystemStepOnePlus進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)。按照兩步法擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到各孔的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各樣本數(shù)據(jù)。

1.6 Western blot將轉(zhuǎn)染CLDN18-ARHGAP26融合突變基因48 h的NSP細(xì)胞培養(yǎng)基倒掉，用無菌PBS洗滌2次，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。分別配制分離膠和濃縮膠，蛋白電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次8 min；二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次8 min。滴加適量ECL底物顯色劑曝光，掃描圖像，應(yīng)用Image J軟件分析掃描蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 CCK-8檢測藥物敏感性將100 μl細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板每孔5×104個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度梯度的L-OHP(0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml)培養(yǎng)24 h，加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，讀取490 nm處吸光度值。計(jì)算細(xì)胞活力(%)=[A(待測孔)-A(空白孔)]/[A(對(duì)照孔)-A(空白孔)]×100%

2 結(jié)果

2.1 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后ABCG2蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)分選胃癌細(xì)胞系BGC-823的SP(1.3%)和NSP(98.7%)細(xì)胞(圖1A)，將得到NSP用于本研究。以慢病毒為載體攜帶過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因于NSP細(xì)胞中，用qPCR檢測CLDN18-ARHGAP26融合突變基因和ABCG2的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的表達(dá)增加(圖1B)。細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因后ABCG2 mRNA的表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖1C)。

圖1 NSP細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的效率和ABCG2的表達(dá)A：細(xì)胞分選儀分選BGC-823細(xì)胞SP和NSP細(xì)胞；B：qPCR檢測CLDN18-ARHGAP26融合突變基因；C：ABCG2的mRNA表達(dá)；Control組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒；Lentivirus組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因的慢病毒；與Control組比較：***P<0.001

2.2 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后E-Cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)Western bolt檢測EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Control組細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)高于Lentivirus組細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)(t=4.372，P<0.01)，Lentivirus組細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)高于Control組(t=6.674，P<0.01)。見圖2。

圖2 過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因的NSP細(xì)胞發(fā)生EMTA：Western bolt檢測E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；B：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量；與Control組比較：**P<0.01

2.3 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后對(duì)L-OHP耐藥性的影響不同濃度L-OHP處理轉(zhuǎn)染慢病毒的NSP細(xì)胞24 h后，用CCK-8檢測其對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果顯示，不同濃度L-OHP對(duì)NSP細(xì)胞增殖均有抑制作用，IC50為4.28 μg/ml。過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合基因后，L-OHP對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，IC50為15.87 μg/ml。見圖3。

圖3 NSP細(xì)胞過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因后對(duì)L-OHP耐藥性的影響 與Control組比較：**P<0.01

2.4 人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響為了研究人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響。先用不同濃度(0、10、30、50、100 μg/ml)人參皂苷處理NSP細(xì)胞，結(jié)果顯示，50、100 μg/ml人參皂苷明顯抑制NSP細(xì)胞增殖，10 μg/ml人參皂苷對(duì)NSP細(xì)胞增殖沒有明顯作用，因此選用30 μg/ml作為人參皂苷刺激NSP的有效濃度(圖4A)。進(jìn)一步檢測30 μg/ml人參皂苷和不同濃度L-OHP對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示人參皂苷和L-OHP聯(lián)合用藥降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。提示人參皂苷能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因引起的對(duì)L-OHP的耐藥作用。見圖4B。

圖4 人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞耐藥性的影響與L-OHP組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用Western bolt檢測人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，人參皂苷處理的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的E-Cadherin蛋白表達(dá)高于單純轉(zhuǎn)染組(t=18.063，P<0.01)，Vimentin蛋白的表達(dá)為(0.37±0.12)，低于單純轉(zhuǎn)染組(t=4.011，P<0.05)。見圖5。

圖5 人參皂苷對(duì)過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26突變基因的NSP細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用A：Western bolt檢測E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；B：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量；1：Lentivirus組；2：Lentivirus+人參皂苷組；與Lentivirus組比較：**P<0.01

3 討論

有研究[6]表明100個(gè)胃癌患者中有3個(gè)CLDN18(一個(gè)使細(xì)胞間緊密結(jié)合的基因)和ARHGAP26(一個(gè)編碼RHOA抑制劑的基因)發(fā)生突變，融合形成了CLDN18-ARHGAP26，細(xì)胞和細(xì)胞及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的附著力降低，表現(xiàn)出EMT，這種突變可能導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。2018年Yang et al[7]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)了CLDN18-ARHGAP26融合突變與胃印戒細(xì)胞癌臨床診斷/預(yù)后指標(biāo)和化療耐藥顯著相關(guān)，該研究表明目前的化療方式對(duì)腫瘤中存在該融合基因的患者效果不好。該研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因，在細(xì)胞水平上探索其對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性和侵襲性的影響。

有研究[8]對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中均有少量側(cè)群(SP)細(xì)胞，比例大約在1%～4%之間。ABCG2是與腫瘤多藥耐藥性密切相關(guān)的多藥耐藥跨膜蛋白，SP細(xì)胞表現(xiàn)出高表達(dá)ABCG2的特點(diǎn)，SP細(xì)胞ABCG2的表達(dá)比NSP細(xì)胞高3倍。而對(duì)于未分選細(xì)胞(SP+NSP)來說，ABCG2的表達(dá)并不高，但是在進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥后ABCG2的表達(dá)明顯升高[9]。該研究利用流式細(xì)胞分選儀分選出BGC-823細(xì)胞中的NSP細(xì)胞，顯示NSP細(xì)胞中過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26融合突變基因能使ABCG2表達(dá)明顯升高。

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞喪失極性和細(xì)胞間接觸等上皮細(xì)胞樣表型，轉(zhuǎn)化成具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過程。在肺癌細(xì)胞中，EMT的發(fā)生與腫瘤的侵襲性和耐藥性有關(guān)[10]。E-Cadherin是參與細(xì)胞之間黏附連接的主要蛋白分子，主要分布于上皮細(xì)胞中，發(fā)揮著維持細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的功能[11]。波形蛋白(Vimentin)是間充質(zhì)細(xì)胞的主要骨架成分。因此，Vimentin常被用作EMT的細(xì)胞標(biāo)記物[12]。一般情況下，E-Cadherin蛋白表達(dá)降低和Vimentin蛋白表達(dá)增加提示發(fā)生了EMT。過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26基因的NSP細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，而Vimentin蛋白表達(dá)顯著增加，表明細(xì)胞發(fā)生了EMT。為了研究CLDN18-ARHGAP26融合突變基因?qū)Π┘?xì)胞耐藥性的影響，該研究利用化療藥L-OHP對(duì)分選的BGC-823 NSP細(xì)胞進(jìn)行耐藥測試。該研究用CCK-8檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)CLDN18-ARHGAP26基因的NSP細(xì)胞對(duì)L-OHP產(chǎn)生了耐藥。人參的主要成分是人參皂苷，人參皂苷能通過調(diào)控NF-κB、ERK、Akt信號(hào)通路等抑制癌細(xì)胞的EMT，從而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程[13]。為探究人參皂苷干預(yù)對(duì)CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT和耐藥性的影響，該研究首先確定了人參皂苷對(duì)BGC-823 NSP細(xì)胞的有效作用濃度為30 μg/ml。NSP細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒之后給予人參皂苷和L-OHP干預(yù)，只用L-OHP的細(xì)胞存活率明顯低于同時(shí)給予人參皂苷和L-OHP的細(xì)胞，提示人參皂苷能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的耐藥。同時(shí)檢測了兩組細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，人參皂苷也能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT作用。

綜上，人參皂苷干預(yù)能逆轉(zhuǎn)CLDN18-ARHGAP26過表達(dá)引起的EMT和耐藥，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。該研究對(duì)腫瘤化療藥物的研究及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用有指導(dǎo)意義。