李 交，肖友元，謝 沁，馬天蓉，李劍萍，段 俊，蘇 懋

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是世界范圍內(nèi)導致癡呆的最常見原因，部分原因是世界人口老齡化。這種神經(jīng)退行性疾病有兩個典型的臨床特征：記憶喪失和認知障礙。AD的主要病理特征是淀粉樣蛋白斑塊沉積和過度磷酸化的tau蛋白神經(jīng)原纖維纏結、細胞凋亡、自噬功能障礙、神經(jīng)炎癥、氧化應激和線粒體功能障礙[1]。盡管AD帶來了重大的公共健康問題，但目前僅有5種藥物被批準用于治療AD，而這些藥物的作用是控制癥狀、延緩癡呆癥的發(fā)作，從而減慢病程加劇的速率[2]。研究[3]表明Wnt/β-catenin信號通路的持續(xù)缺失是AD發(fā)生和進展的基礎，該信號通路參與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)處理、肽類神經(jīng)毒性、磷酸化和腦內(nèi)載脂蛋白E功能調(diào)節(jié)。6-姜酚[(5S)-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)癸烷-3-酮]是生姜的主要藥理活性成分[4]。與6-姜烯酚、8-姜酚和10-姜酚(生姜中的其他三種植物化學物質(zhì))相比，6-姜酚被報道具有廣泛的生物化學和藥理作用，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤能力[4-6]。研究[7]表明6-姜酚能夠減輕乏氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞損傷，其機制與抑制氧化應激和炎癥反應有關。6-姜酚通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制3T3-L1細胞的成脂分化[8]。該實驗旨在研究6-姜酚通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路對β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)誘導的AD大鼠細胞凋亡、氧化應激和神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 分組及阿爾茨海默病大鼠模型建立大鼠隨機均分為6組：對照組、模型組、低劑量6-姜酚組、中劑量6-姜酚組、高劑量6-姜酚組和陽性對照組。將所有大鼠腹腔注射氯胺酮和二甲苯(按體質(zhì)量分別為80 mg/kg和20 mg/kg)進行麻醉，除對照組外，其余各組注射Aβ1-421.0 μl構建阿爾茨海默病大鼠模型。方法[9]：制備合成低聚Aβ1-42溶液， Aβ1-42在PBS溶液溶解，使用前在37 ℃孵化72 h，孵化72 h后使用1 μl漢密爾頓注射器從大鼠雙側大腦的海馬體中，以0.1 μl/min速度注射Aβ1-421.0 μl。模型建立第15天時，低、中、高劑量6-姜酚組灌胃6-姜酚50、75、100 mg/kg，陽性對照組灌胃鹽酸多尼哌齊0.9 mg/kg，對照組和模型組灌胃相同體積的0.9%氯化鈉溶液，均每日1次，連續(xù)21 d。

1.2 神經(jīng)損傷評分神經(jīng)損傷在各組大鼠制模15 d后進行評分，具體參考Longa神經(jīng)評分法[10]。0分：正常，無神經(jīng)損傷；1分：左側前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)損傷；2分：行走時，大鼠向癱瘓側轉圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向癱瘓側傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。

1.3 腦含水量的檢測腦組織含水量的測定[11](干濕重法測定)：取小鼠腦組織約100 mg，稱重(濕腦重量)，將腦組織置于110 ℃的烤箱中烘烤24 h以上至恒重后，稱取干腦重量。計算公式：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 HE染色HE染色，采集大鼠海馬體，用蘇木精-伊紅染色，并在顯微鏡下進行觀察。

1.5 TUNEL染色采集大鼠海馬體，用切片機將不同組的石蠟包埋的組織切成薄片(厚度為3 μm)。常規(guī)對組織進行脫蠟，并加入50 μl 3%過氧化氫溶液。隨后將切片在20 ℃下孵育10 min，并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3次。將切片在50 μl TUNEL中于37 ℃孵育60 min。然后，在加入50 μl過氧化物酶(POD)在37 ℃下再次孵育30 min，并用PBS沖洗3次。將Dolichosbiflorusagglutinin(DBA)試劑盒中的試劑A、B和C各1滴加入1 ml蒸餾水中混勻，再滴加至切片顯色10 min。之后，將切片用PBS洗滌3次，用蘇木精復染10 s。用顯微鏡觀察和計數(shù)凋亡細胞(顏色為黃棕色)。圖像是用OLYMPUS DX51熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)拍攝的。在每個組織切片中評估心肌細胞區(qū)域的積分選擇密度(integrated option density，IOD)和面積，然后獲得平均吸光度值(OD = IOD /面積)。選擇了4個切片，每切片4個視野。

1.6 流式細胞術采用Annexin v-熒光素(AV)和碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(Invitrogen公司，美國) 流式細胞術檢測不同處理組細胞的凋亡率。簡單地說用胰蛋白酶分解的細胞，在藥物刺激后，用PBS洗滌后，10 L Annexin V-FITC和5 L PI在室溫黑暗中孵育15 min。流式細胞術使用FACScan流式細胞儀(美國貝克曼庫爾提公司)進行流式分析，數(shù)據(jù)使用FlowJo軟件(美國Tree Star公司) 進行分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)根據(jù)制造商的說明，直接測量海馬體組織中的細胞因子(iNOS、IL-6和TNF-α)和氧化應激指標(SOD、GSH-Px和MDA)的表達量。用BIO-RAD酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定吸光度值。使用ELISA試劑盒提供的細胞因子標準品建立測量的標準曲線。

1.8 提取總RNA、反轉錄和熒光定量使用TRIzol從海馬體組織提取總RNA，提取的總RNA首先去除基因組中的 DNA，然后進行反轉錄，以上步驟根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。熒光定量檢測反應體系：5 μl的SYBR Premix，各0.5 μl的上游引物和下游引物，3 μl的 RNase Free dH2O，1 μl的cDNA。程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共40個循環(huán)。擴增完成后進行熔解曲線分析：95 ℃維持10 s，65 ℃處理1 s,此后從65 ℃開始，每一個循環(huán)溫度增加0.5 ℃，時間為1 s。

1.9 Western blot實驗海馬體加入液氮研磨，并用裂解緩沖液裂解在4 ℃并以14 000 r/min離心15 min，形成濃縮蛋白質(zhì)。然后測量蛋白質(zhì)濃度。取20 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在37 ℃下用1 h封閉5%的牛血清白蛋白，然后與抗Wnt和β-catenin在4 ℃過夜。用TBST緩沖液(含Tween-20的Tris緩沖鹽水)清洗，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應1 h；洗膜后ECL曝光成像并應用Quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠神經(jīng)損傷和腦含水量的影響神經(jīng)損傷評分檢測結果表明，模型組大鼠神經(jīng)損傷程度在(3.08±0.46)分。而中劑量和高劑量組大鼠神經(jīng)損傷程度降低(P<0.05)，且陽性對照組鼠神經(jīng)損傷程度降低(P<0.01)。腦含水量的檢測結果表明，模型組大鼠腦含水量在(89.76±6.33)%。中劑量和高劑量6-姜酚組大鼠腦含水量減少(P<0.05)，且陽性對照組大鼠腦含水量減少(P<0.01)。見表1。

表1 神經(jīng)損傷及腦含水量測定

2.2 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠海馬體病理損傷的影響HE染色結果表明，模型組AD大鼠海馬體椎體細胞神經(jīng)元萎縮，細胞空泡化，細胞疏松。而中劑量和高劑量6-姜酚組或陽性對照組治療后Aβ誘導的AD大鼠，上述情況明顯好轉。見圖1。

圖1 海馬體病理切片HE染色 ×400A：對照組；B：模型組；C：低劑量6-姜酚組；D：中劑量6-姜酚組；E：高劑量6-姜酚組；F：陽性對照組

2.3 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠海馬體細胞凋亡的影響流式細胞術和TUNEL染色檢測結果表明，模型組AD大鼠細胞凋亡升高(P<0.01)，而中劑量和高劑量6-姜酚組AD大鼠細胞凋亡降低(P<0.05)，且陽性對照組AD大鼠細胞凋亡降低(P<0.01)。流式細胞檢測細胞凋亡各組比較F=155.649，P<0.01；TUNEL染色檢測細胞凋亡各組比較F=80.754，P<0.01。見圖2。

圖2 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠海馬體細胞凋亡的影響A：流式細胞檢測細胞調(diào)亡率；B：TUNEL染色細胞調(diào)亡率; 1：對照組；2：模型組；3：低劑量6-姜酚組；4：中劑量6-姜酚組；5：高劑量6-姜酚組；6：陽性對照組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AD大鼠模型組比較：##P<0.01

2.4 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠海馬體促炎細胞因子的影響ELISA檢測結果表明，模型組AD大鼠海馬體中促炎因子iNOS、IL-6和TNF-α的表達量均上調(diào)(P<0.01)，而G與模型組比較中劑量和高劑量6-姜酚組AD大鼠海馬體中促炎因子iNOS，IL-6和TNF-α的表達量均下調(diào)(P<0.05)，且陽性對照組AD大鼠海馬體中促炎因子iNOS、IL-6和TNF-α的表達量均下調(diào)(P<0.01)。見表2。

表2 促炎因子iNOS，IL-6和TNF-α表達量的測定

2.5 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠海馬體氧化應激的影響ELISA檢測結果表明，模型組AD大鼠海馬體中氧化應激標志物SOD和GSH-Px的表達量均下調(diào)(P<0.01)，氧化應激標記物MDA的表達量上調(diào)(P<0.01)。而與模型組比較中劑量和高劑量6-姜酚組AD大鼠SOD和GSH-Px的表達量均上調(diào)(P<0.05)，MDA的表達量下調(diào)(P<0.05)。且陽性對照組AD大鼠SOD和GSH-Px的表達量均上調(diào)(P<0.01)，MDA的表達量下調(diào)(P<0.01)。見表3。

表3 氧化應激標志物SOD、GSH-Px和MDA表達量的測定

2.6 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響qRT-PCR和Western blot檢測結果表明，模型組AD大鼠Wnt和β-catenin的mRNA和蛋白相對表達量均下調(diào)(P<0.01)，而與模型組比較中劑量和高劑量6-姜酚組AD大鼠Wnt和β-catenin的mRNA和蛋白相對表達量均上調(diào)(P<0.05)，且陽性對照組AD大鼠Wnt和β-catenin的mRNA和蛋白相對表達量均上調(diào)(P<0.01)。qRT-PCR檢測Wntm RNA相對表達量(F=215.364，P<0.001)；qRT-PCR檢測β-cateninm RNA相對表達量(F=286.140，P<0.001)；Western blot檢測Wnt蛋白相對表達量(F=23.304，P<0.01)；Western blot檢測β-catenin蛋白相對表達量(F=36.703，P<0.01)。見圖3。

圖3 6-姜酚對Aβ誘導的AD大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響A：qRT-PCR檢測Wnt和β-catenin的mRNA相對表達量；B：Western blot檢測Wnt和β-catenin的蛋白相對表達量；1：對照組；2：模型組；3：低劑量6-姜酚組；4：中劑量6-姜酚組；5：高劑量6-姜酚組；6：陽性對照組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，會導致記憶、判斷和推理等精神和認知過程的逐漸衰退[12]。6-姜酚通過下調(diào)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/雷帕霉素哺乳動物靶標(mTOR)/信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)通路，抑制小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥，從而改善腦缺血損傷[13]。該實驗中在6-姜酚治療后Aβ誘導的AD大鼠后，大鼠神經(jīng)損傷程度顯著下調(diào)，腦含水量顯著下調(diào)。結果表明6-姜酚對腦組織有保護作用。

AD的病理表現(xiàn)為細胞凋亡、神經(jīng)炎癥和氧化應激。氧化應激是AD發(fā)病機制中的一個重要因素，對淀粉樣蛋白的生成具有重要作用。AD與血腦屏障的通透性增加有關。氧化應激降低了低密度脂蛋白受體相關蛋白1的表達，上調(diào)了血腦屏障中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的表達，增加了血腦屏障的通透性，這可能會導致蛋白在AD腦內(nèi)的沉積增多。凋亡發(fā)生在AD的發(fā)病過程中，氧化應激通過外在途徑和內(nèi)在途徑促進細胞凋亡。氧化應激誘導的細胞凋亡可能是導致細胞凋亡的潛在因素[14]。研究[7]表明，6-姜酚能夠減輕乏氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞損傷，其機制與抑制氧化應激和炎癥反應有關。以上文獻表明，改善AD細胞調(diào)亡，氧化應激和神經(jīng)炎癥有助于緩解AD造成的神經(jīng)損傷。在該實驗中，6-姜酚治療后，細胞凋亡率降低，促炎細胞因子iNOS、IL-6和TNF-α的表達量下調(diào)，SOD和GSH-Px的蛋白含量上調(diào)，而MDA蛋白含量下調(diào)。結果表明6-姜酚能緩解Aβ誘導的AD大鼠細胞凋亡、氧化應激和神經(jīng)炎癥。

在AD中，典型Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)，而過氧化物酶體增殖激活受體上調(diào)。Wnt/β-catenin的下調(diào)，是通過淀粉樣蛋白β激活糖原合酶激酶3β以及磷脂酰肌醇3激酶/ 絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號失活而引起的[15]。研究[8]表明，6-姜酚通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制3T3-L1細胞的成脂分化。該實驗中6-姜酚治療后Wnt和β-catenin的mRNA和蛋白相對表達量均顯著上調(diào)。這些結果表明6-姜酚能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路緩解Aβ誘導的AD損傷。

綜上所述，該研究表明6-姜酚能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路緩解Aβ誘導的AD大鼠細胞凋亡、氧化應激和神經(jīng)炎癥。該研究僅為體內(nèi)實驗初步探討6-姜酚具有緩解AD的治療效果，為進一步研究6-姜酚藥理學功能提供參考。