董慶泰，林振宇，李中虎，張智勇，馬丹丹，蔡 遜

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在2018年公布的全球36種惡性腫瘤數(shù)據(jù)中，肝癌患者占惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)4.7%，位居第7位；肝癌患者占死亡病例數(shù)8.2%，位居第2位[1]。原發(fā)性肝癌中85%～90%病理分型為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[2]。目前HCC最有效的治療手段是早期手術，且早期診療患者的5年生存率超過70%，遠高于晚期(低于16%)[3]。但HCC起病隱匿，大多數(shù)患者首次診斷即為中晚期，錯過了最佳手術時機[4]。因此，尋找對HCC敏感且特異性高的新型生物標志物和新的腫瘤基因治療靶點有重大意義。

Progestin and adipoQ receptor family member 4(PAQR4)屬于PAQR基因組家族(PAQR1-PAQR11)中的一員，定位于人類染色體16p13.3，包含3個外顯子[5]。已有研究表明PAQR4參與人體惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌[6]、非小細胞肺癌[7-8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]，且PAQR4都表現(xiàn)出癌基因的特性。但目前PAQR4在HCC中的表達及其對HepG2細胞生物學特性影響的研究報道甚少。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析收集TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫中PAQR4在HCC中的基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，利用R語言整理兩組數(shù)據(jù)，并分析PAQR4在HCC中的表達差異及臨床預后。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染肝癌HepG2細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。HepG2細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待貼壁后，使用陽離子脂質載體Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-PAQR4質粒轉染HepG2細胞作為實驗組，將空載體pcDNA3.1-vector轉染HepG2細胞作為其對照組。轉染48 h后收集細胞，通過RT-PCR(Real-time PCR)測定法評估轉染效率。

1.3 CCK-8實驗取對數(shù)生長期HepG2細胞接種于96孔板，24 h后轉染，分為實驗組和對照組。設置復孔4個/組，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入CCK-8試劑，每孔10 μl，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。最后進行檢測(酶標儀波長450 nm)，記錄吸光度值。

1.4 Transwell實驗胰酶消化對照組和實驗組細胞，調整細胞密度為1.0×108個/L，并接種到含有無血清培養(yǎng)基的Transwell小室上層中，加入細胞懸液100 μl/孔。下室內加入600 μl新鮮培養(yǎng)基。置入配養(yǎng)箱中培育24 h后，在室溫下每孔加入4%多聚甲醛1 ml固定10 min，甲醇對細胞通透處理20 min，0.1%結晶紫染液染色20 min，棉簽擦去上室未遷移細胞，自然風干后在顯微鏡下以200倍放大觀察染色細胞。設置復孔3個/組。

1.5 劃痕實驗取對數(shù)生長期的對照組和實驗組細胞，分別用胰酶消化后鋪于6孔板中，接種細胞約5×105個/孔。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞鋪滿貼壁，用10 μl消毒槍頭垂直劃痕，PBS沖洗3遍，加入無血清DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、24、48 h拍攝顯微鏡放大200倍下的圖片。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡用胰酶消化對照組和實驗組的細胞，制成細胞懸浮液，調整密度為1.0×105個/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)48 h后，PBS清洗2次，低溫下加入Binding Buffer重懸細胞。室溫避光條件下取100 μl結合緩沖液重懸細胞加入5 μl的 AnnexinV-FITC反應10 min，再加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide, PI)反應10 min。最后加入400 μl Binding Buffer緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡。設置復孔3個/組。

2 結果

2.1 PAQR4 mRNA在HCC組織和癌旁組織中的表達差異收集整理出TCGA數(shù)據(jù)庫中關于HCC共424個樣本，包括50個癌旁組織和374個癌組織，PAQR4 mRNA在癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1A。50例HCC患者的配對癌組織和癌旁組織中，癌組織中PAQR4 mRNA的表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1B。

圖1 采用Wilcoxon signed-rank檢驗分析PAQR4在非配對和配對的癌組織和癌旁組織樣本中的表達水平A：非配對；B：配對；與癌旁組織比較：***P<0.001

2.2 PAQR4與HCC患者臨床預后的關系在全部374個癌組織樣本中，PAQR4 mRNA高表達組總體生存率低于低表達組，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)，見圖2。HCC患者Cox回歸分析結果如表1所示，單因素Cox分析結果顯示PAQR4 mRNA表達水平(HR=1.104, 95%CI:1.051～1.160,P<0.001)、T分期(HR=1.816, 95%CI:1.442～2.287,P<0.001)、M分期(HR=3.924，95%CI:1.230～12.519,P=0.021)、病理分期(HR=1.879, 95%CI:1.466～2.408,P<0.001)對HCC患者的預后存在顯著影響。多因素Cox分析結果顯示PAQR4 mRNA表達水平(HR=1.396, 95%CI:1.081～1.804,P=0.011)是HCC患者預后的獨立危險因素。

圖2 PAQR4 mRNA表達水平對HCC患者的總體生存的影響

表1 Cox回歸比例風險模型分析HCC患者PAQR4 mRNA表達水平及其他臨床病理特征與總生存率的相關性

2.3 過表達PAQR4對HepG2細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示，24、48、72 h時實驗組的OD值較對照組更高，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.05、10.47、3.82,P<0.05 )。見圖3。上述結果表明PAQR4促進了HepG2細胞的增殖。

圖3 CCK-8檢測PAQR4對HepG2細胞增殖的影響與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 過表達PAQR4對HepG2細胞侵襲的影響Transwell實驗結果顯示，24 h后實驗組侵襲細胞數(shù)較對照組更多，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.03,P<0.01)。見圖4。結果表明PAQR4增加了HepG2細胞的侵襲能力。

圖4 Transwell檢測PAQR4對HepG2細胞侵襲的影響 ×200與對照組比較：**P<0.01

2.5 過表達PAQR4對HepG2細胞遷移的影響劃痕實驗結果顯示，24、48 h后實驗組愈合率較對照組更高，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.13、4.40,P<0.05)。見圖5。以上表明PAQR4增加了HepG2細胞的遷移能力。

圖5 劃痕實驗檢測PAQR4對HepG2細胞侵襲的影響 ×200與對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.6 過表達PAQR4對HepG2細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，48 h后實驗組細胞存活率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=41.44,P<0.001)。見圖6。此結果表明PAQR4抑制了HepG2細胞凋亡。

圖6 PI & Annexin V檢測PAQR4對HepG2細胞凋亡的影響與對照組比較：***P<0.001

3 討論

PAQR家族(PAQR1-PAQR11)基因最先由Tang et al[5]于2005年定義并命名，該家族所有成員所編碼的蛋白都包含7個跨膜域，但其拓撲結構又不同于傳統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白。目前，國內外已有研究表明人體內PAQR家族基因的異常表達與體內惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，如胃癌[11]、結腸癌[12]、肝癌[13]等。PAQR4作為PAQR家族基因中的一員在腫瘤的發(fā)生中同樣起著關鍵作用，有報道[14]表明PAQR4和SKP2通過相互之間的拮抗作用調節(jié)老鼠體內CDK4蛋白的水平進而間接參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這為后續(xù)PAQR4在人體內腫瘤的相關研究提供了線索，但目前國內外關于PAQR4在HCC中的表達及意義的研究甚少。

Zhang et al[6]研究表明PAQR4 mRNA的表達水平在乳腺癌組織及配對癌旁組織中的表達存在差異，且PAQR4 mRNA的高表達與乳腺癌患者更差的預后相關。在非小細胞肺癌患者的癌組織中PAQR4呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，且PAQR4高表達的非小細胞肺癌患者相對于PAQR4低表達的患者的總體生存率更低[8]。PAQR4 mRNA在前列腺癌組織中的表達量相對于其配對癌旁組織中的表達量高，且PAQR4 mRNA的高表達與前列腺癌的大小、病理分期和遠處轉移相關[9]。PAQR4 mRNA在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織[10]。這些研究均提示PAQR4在人體惡性腫瘤的發(fā)生中表現(xiàn)出癌基因的特性。在該研究中，利用從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的高通量RNA測序數(shù)據(jù)，對PAQR4在HCC中的表達和預后進行了生物信息學分析；結果顯示PAQR4 mRNA在HCC組織中高表達，且PAQR4 mRNA高表達的HCC患者總體生存率更低。這與國內外研究結果基本一致。此外，該研究還表明PAQR4 mRNA的表達水平是HCC患者的獨立預后因素，這說明在該研究中所涉及的臨床病理特征中，PAQR4 mRNA的表達水平對HCC患者預后有明顯的影響。由于該研究中所納入的臨床病理特征有限，PAQR4 mRNA的表達水平在納入更多臨床病理特征的多因素分析中是否仍是HCC患者預后的獨立影響因素需要進一步研究。

為了進一步探討PAQR4與肝癌的關系，該研究通過構建PAQR4過表達的HepG2細胞株，結果提示過表達PAQR4可顯著促進HepG2肝癌細胞的增殖、侵襲、遷移，與此同時，PI和Annexin V雙染實驗的結果也表明過表達PAQR4對HepG2細胞凋亡起抑制作用。Wu et al[7]的研究表明過表達PAQR4促進A549肺癌細胞增殖、侵襲、遷移。過表達PAQR4能夠促進PC53和DU145前列腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移和上皮-間質細胞之間的轉換[9]。在胃癌中miR-370的直接作用靶點在PAQR4的3′UTR，miR-370的敲除會導致SGC7901胃癌細胞中PAQR4的表達量增加；與此同時，過表達PAQR4能夠逆轉miR-370對胃癌細胞的增殖、侵襲和上皮-間質細胞之間的轉換[10]。國內外研究均提示PAQR4過表達促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移，這與該研究結果相同。以上提示PAQR4有可能成為預測HCC的候選生物標志物。

綜上所述，該研究初步探討了PAQR4基因對HCC患者預后影響及其在HepG2細胞中的作用，證明了PAQR4在HCC組織中高表達且與預后相關，過表達PAQR4促進HepG2細胞的增殖、侵襲、遷移，且過表達PAQR4抑制HepG2細胞的凋亡。PAQR4有可能成為HCC診斷和預后的新標志物。