王 成，孫凡凡，張俊戈，孫家強，董六一

聽力損失是臨床上常見的感覺障礙形式，噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)占成年人聽力損失的16%[1]，且有逐年增加的趨勢。目前，臨床上尚缺乏有效的預(yù)防或治療措施[2]，對NIHL的關(guān)注和研究已成為當(dāng)前世界各國臨床耳科醫(yī)學(xué)工作者的研究熱點。

環(huán)磷酸腺苷(adenosine cyclophosphate,cAMP)作為細胞內(nèi)重要的的第二信使，可調(diào)控多種信號通路，如細胞再生、修復(fù)等。cAMP的效應(yīng)器除了已被充分研究的cAMP蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)外，還有由cAMP直接激活的環(huán)腺苷酸結(jié)合蛋白(exchange protein directly activated by cAMP，Epac)[3]。Epac是Ras家族小分子G蛋白Rap的交換因子，可促使無活性的GDP轉(zhuǎn)換為有活性的GTP，并激活Rap蛋白，參與下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究[4]表明Epac-Rap1作為一個新的重要途徑在cAMP信號通路中發(fā)揮重要作用。已有大量文獻[5]報道Epac在神經(jīng)元生長、再生與修復(fù)等功能作用中的相關(guān)研究，但Epac在NIHL中作用的研究國內(nèi)外未見相關(guān)報道。該文主要探討在噪聲暴露條件下Epac1信號是否介導(dǎo)大鼠內(nèi)耳毛細胞病理性損傷過程并初步研究其作用與機制，期望為NIHL的防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量為250～350 g，耳廓反應(yīng)靈敏，于飼養(yǎng)室(22±3)℃，濕度40%～70%，飼養(yǎng)1周。動物購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：[SCXK(皖)2017-001]，動物倫理報告編號：LLSC20200760。SD大鼠隨機分為對照組和噪聲暴露組，10只/組。

1.2 藥品與試劑10% EDTA脫鈣液購自西安赫特生物科技有限公司；PMSF購自美國Sigma公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；預(yù)染蛋白marker購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔來源Epac1一抗、兔來源CaMKⅡ一抗、鼠來源Rap1一抗、兔來源Bax、Bcl-2購自美國Abcam公司；cleaved caspase-3/9一抗；內(nèi)參β-actin購自美國CST公司；兔來源Epac1一抗(免疫熒光)購自北京博奧森生物科技有限公司；iFluor488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(綠色)購自上海翊圣生物科技有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗、ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、封閉用羊血清(批號：ZLI-9022)購自北京中杉金橋有限公司；Triton X-100購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備靜音室(廣州聲左聲學(xué)技術(shù)有限公司)；噪聲揚聲器(上海創(chuàng)目公司)；功能放大器(日本YAMAHA公司)；聲壓計(杭州愛華公司)；Tucker Davis Technologies(TDT)系統(tǒng)(美國Tucker-Davis公司)；測聽揚聲器(美國Tucker-Davis公司)；校準(zhǔn)麥克(美國Tucker-Davis公司)；超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；TGL-16H高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；DIAX-900內(nèi)切式組織勻漿機(德國Heidolph公司)；TE300型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；SpectraMax190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；WD-9405B水平搖床(北京市六一儀器廠)；Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司)；蔡司顯微鏡(德國ZEISS公司)；冷凍研磨儀(上海凈信公司)。

1.4 方法

1.4.1噪聲暴露 將噪聲暴露組大鼠暴露于中心頻率為4 kHz，聲強度為101 dB SPL的寬頻噪聲中8 h。應(yīng)用聲級計測量和調(diào)整噪聲強度。

1.4.2聽覺腦干反應(yīng)(auditory brainstem responses,ABR)測量 實驗前 ，噪聲暴露后分別對兩組大鼠進行 ABR 檢測。腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)麻醉大鼠。將皮下電極插入顱骨的頂點，參考電極插入左耳下的乳突處接地電極插入右耳下的乳突處。以寬頻的Click(0.1 ms，21次/s)聲及 Tone burst 聲(4、8、12、16、20、24、32 kHz；0.5 ms上升/下降期，無平臺期，交替相位)為刺激聲，Tucker Davis Technology (TDT) 系統(tǒng)Ⅲ硬件及Biosig軟件進行測量。每個刺激水平的重復(fù)高達521次。從90 dB開始，每5 dB逐級下降，直到檢測不到重復(fù)的波形，確定閾值。所有ABR測量均由同一實驗者進行。

1.4.3基底膜鋪片染色 對照組與噪聲暴露組大鼠(n=3)于噪聲暴露24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉后迅速斷頭，取出顳骨，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗1次，將耳蝸浸泡在4%多聚甲醛中，4 ℃過夜后取出耳蝸，PBS漂洗3次，10% EDTA脫鈣液中浸泡5 d。在解剖顯微鏡下去除側(cè)壁、Reissner膜和覆膜，將基底膜用iFluor488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(在PBS中1 ∶1 000稀釋)染色30 min，用PBS漂洗后，置于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察毛細胞。

1.4.4免疫熒光染色 將大鼠耳蝸基底膜置于3% Triton X-100溶液中透化30 min，PBS 洗滌3次(10 min/次)后于室溫下山羊血清封閉30 min，4 ℃與Epac 1(1 ∶100)孵育24 h，洗滌3次后，置于FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG的二抗(1 ∶50)中，4 ℃避光過夜。將樣品用PBS洗滌3次，并與iFluor488鬼筆環(huán)肽(1 ∶1 000)室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌3次，置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.4.5透射電鏡 將大鼠耳蝸基底膜進行乙醇梯度脫水，用spurr環(huán)氧樹脂進行包埋、切片，約70 nm/片。將制好的切片用1%甲苯胺藍進行染色，透射電鏡下觀察耳蝸超微結(jié)構(gòu)。

1.4.6Western blot 使用Western blot法檢測大鼠耳蝸組織Epac1、CaMK-Ⅱ、Rap1通路相關(guān)蛋白和Bax、Bcl-2、CC3、CC9等凋亡蛋白表達的變化(n=3)。通過Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用 Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠噪聲暴露前后ABR閾值變化ABR檢測，噪聲暴露后，對照組與噪聲暴露組大鼠在12 kHz時的ABR波形。實驗結(jié)果顯示，噪聲暴露前對照組與噪聲暴露組大鼠的ABR閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。噪聲暴露后對照組大鼠4、8、12、16、20、24及32 kHz ABR聽力閾分值別為(31.00±1.87)、(30.00±2.74)、(31.00±1.87)、(32.00±3.39)、(36.00±3.32)、(38.00±2.00)、(39.00±2.45 )dB SPL，噪聲暴露組大鼠聽力閾值為(64.00±1.87)、(67.00±5.61)、(73.00±2.55)、(74.00±1.87)、(73.00±2.25)、(84.00±2.45)、(82.00±1.13) dB SPL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.747、8.687、9.860、9.860、10.303、10.800、10.100，P<0.01)。噪聲暴露后對照組大鼠的Click值為(25.00±2.24) dB SPL，噪聲暴露組大鼠為(52.00±5.83) dB SPL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.416，P<0.01)。

2.2 噪聲暴露后大鼠內(nèi)耳外毛細胞損傷情況鬼筆環(huán)肽對大鼠耳蝸基底膜進行鋪片染色結(jié)果顯示，對照組大鼠內(nèi)耳三層外毛細胞排列整齊，形態(tài)清晰，基本無細胞缺失；噪聲暴露組大鼠內(nèi)耳三層外毛細胞排列較整齊，但外毛細胞缺失明顯。見圖1 A。內(nèi)耳外毛細胞計數(shù)結(jié)果顯示，對照組大鼠耳蝸外毛細胞缺失率顯著低于噪聲暴露組，差異顯著(t=7.869，P<0.05)。透射電鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠耳蝸毛細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)均勻，線粒體形態(tài)正常、內(nèi)部線粒體嵴清晰可見；噪聲暴露組大鼠毛細胞形態(tài)不規(guī)則，靜纖毛丟失或融合，細胞器損傷嚴(yán)重，線粒體外膜破裂，線粒體脊斷裂或消失，出現(xiàn)空泡化等。見圖1B。

圖1 噪聲暴露后大鼠內(nèi)耳外毛細胞損傷情況A：對照組與噪聲暴露組大鼠耳蝸基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽染色 ×200；B：對照組與噪聲暴露組大鼠耳蝸基底膜透射電鏡觀察結(jié)果 ×5 000；1：對照組；2：噪聲暴露組；與對照組比較：*P<0.05

2.3 免疫熒光檢測大鼠內(nèi)耳毛細胞Epac1蛋白表達采用免疫熒光量化外毛細胞中Epac1免疫標(biāo)記，結(jié)果顯示，對照組大鼠的耳蝸外毛細胞中Epac1表達較弱，而噪聲暴露組大鼠耳蝸外毛細胞中Epac1高表達(t=6.276，P<0.05)。見圖2。

圖2 Epac1免疫標(biāo)記在對照組與噪聲暴露組大鼠中的表達A: Epac1蛋白表達 ×200;B：Epac1蛋白半定量分析；綠色熒光：鬼筆環(huán)肽染色；紅色熒光：Epac1蛋白表達；1：對照組；2：噪聲暴露組;與對照組比較：*P<0.05

2.4 大鼠噪聲暴露后耳蝸組織中Epac1、Rap1和CaMK-Ⅱ蛋白表達情況Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，噪聲暴露組大鼠耳蝸組織中Epac1蛋白表達上調(diào)(t=6.322，P<0.05)，提示噪聲暴露后Epac1蛋白激活，并促進其下游Rap1(t=2.871，P<0.05)和CaMK-Ⅱ(t=2.932，P<0.05)蛋白表達。見圖3。

圖3 對照組與噪聲暴露組大鼠耳蝸Epac1、Rap1和CaMK-Ⅱ蛋白表達量的變化A：Epac1蛋白表達；B：Rap1蛋白表達；C：CaMK-Ⅱ蛋白表達；1：對照組；2: 噪聲暴露組；與對照組比較：*P<0.05

2.5 噪聲暴露后大鼠耳蝸組織中凋亡相關(guān)蛋白表達情況Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，噪聲暴露組大鼠耳蝸組織中Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，其Bcl-2/Bax比值下降(t=3.230，P<0.05)；另外噪聲暴露誘導(dǎo)耳蝸組織中CC3與CC9 激活，其CC3(t=3.014，P<0.05)和CC9(t=4.058，P<0.05) 表達增加，促進毛細胞凋亡。見圖4。

圖4 對照組與噪聲暴露組大鼠耳蝸Bcl-2/Bax、CC3、CC9蛋白表達量的變化A：Bcl-2蛋白表達；B：CC3蛋白表達；C：CC9蛋白表達；1：對照組；2: 噪聲暴露組；與對照組比較：*P<0.05

3 討論

噪聲暴露對內(nèi)耳毛細胞損傷主要通過兩種途徑：一種是直接的機械損傷，機械震動可破壞毛細胞的靜纖毛導(dǎo)致毛細胞缺失，并損傷支持和螺旋神經(jīng)節(jié)[6]；另一種是細胞凋亡或壞死導(dǎo)致毛細胞死亡的生化途徑[7]。目前已知噪聲導(dǎo)致內(nèi)耳毛細胞發(fā)生凋亡的機制有氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、中性粒細胞浸潤、鈣超載等[8]。然而這些非特異性變化與耳蝸損傷間的具體聯(lián)系并無定論，其機制尚不明確。

該文參照了Coleman et al[9]的造模方法，ABR結(jié)果顯示噪聲暴露組大鼠的聽力閾值較對照組大鼠顯著升高(P<0.05)，提示模型構(gòu)建成功。鬼筆環(huán)肽染色及透射電鏡結(jié)果均顯示內(nèi)耳毛細胞形態(tài)發(fā)生異常，證實了噪聲暴露可導(dǎo)致內(nèi)耳毛細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷。

Epac1作為cAMP激活的下游信號傳導(dǎo)途徑，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、血管、腎臟中，涉及如細胞生長、黏附、分化、分裂、胞吐和炎癥等廣泛的細胞功能，同時也是一種影響細胞鈣攝取的關(guān)鍵介質(zhì)[10]。該實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，噪聲暴露組大鼠耳蝸毛細胞Epac1免疫熒光顯示高表達。另外，Western blot結(jié)果也證實噪聲暴露組大鼠耳蝸組織中Epac1、Rap1和CaMK-Ⅱ蛋白表達均明顯上調(diào)。據(jù)文獻[11]報道，Epac的高表達會激活下游的Rap1通路，增加鈣的攝?。?Fazal et al[12]在心肌細胞研究中發(fā)現(xiàn)Epac家族蛋白對心肌細胞線粒體中Ca2+的攝取有激活作用，并且是通過CaMK-Ⅱ調(diào)控Ca2+進入線粒體的；Lezcano et al[13]研究表明Epac可以通過CaMK-Ⅱ調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣的釋放與攝取，進而影響細胞質(zhì)中Ca2+濃度。該實驗結(jié)果提示Epac通路參與了噪聲誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳損傷過程，而Rap1與CaMK-Ⅱ作為Epac的下游蛋白，其表達水平均顯著上調(diào)，提示Epac激活介導(dǎo)大鼠噪聲暴露內(nèi)耳損傷可能與調(diào)控其下游Rap1與CaMK-Ⅱ蛋白表達，促進內(nèi)耳毛細胞鈣超載有關(guān)。

細胞凋亡是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要生理過程。正常細胞中促凋亡和抗凋亡因子之間保持平衡，使細胞維持正常的增殖和生長。如果該平衡被破壞會導(dǎo)致人體多種疾病的發(fā)生，而聽力障礙則是其中一種。已知長時間的鈣超載會導(dǎo)致Bax活化，誘導(dǎo)線粒體外膜的通透性和細胞色素C的釋放，激活下游的Caspase通路從而使細胞發(fā)生凋亡，而Bcl-2可拮抗Bax的表達，調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程[14-15]。該研究結(jié)果顯示噪聲暴露組大鼠耳蝸組織中Bcl-2表達降低，Bax表達上調(diào)，并且Caspase級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白CC3和CC9激活，導(dǎo)致CC3與CC9表達上調(diào)。