唐東暉，鐘映芹，林重，韓亮，鐘艷花

（1.廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院針康科，廣東 廣州 510140；2.廣東藥科大學(xué)健康學(xué)院，廣東 廣州 510006）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征。其病理變化隨病程的進(jìn)展表現(xiàn)有單純性脂肪肝、高脂血癥、高血壓，并被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的一種病理表現(xiàn)。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌。我國NAFLD患病率約30%，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，機(jī)制不清，臨床缺乏有效藥物，嚴(yán)重危害人民健康。

藿樸夏苓湯出自《醫(yī)原》，組方由11味中藥組成，能“理氣和中、燥濕利水”。方中君藥廣藿香配伍臣藥白蔻仁、厚樸、半夏，起“芳香化濕、燥濕運(yùn)脾”之功效，使脾能運(yùn)化水濕，不為濕邪所困。再配伍用茯苓、豬苓、澤瀉、薏苡仁、杏仁、淡豆豉和通草等佐使藥，起“開泄肺氣于上、滲利濕于下”之功效，使肺氣宣降、水道暢通，則水道自調(diào)，濕有去路。該方主治濕熱病邪在氣分而濕偏重者，中醫(yī)臨床上廣泛用于脾胃濕熱證等癥治療[1?2]。前期研究顯示，該方具有抗炎、降脂、保肝等藥理作用[3?8]。然而，關(guān)于其降脂機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本研究旨在小鼠原代肝細(xì)胞水平上觀察藿樸夏苓湯主要成分廣藿香醇對(duì)FXR信號(hào)的影響，探討藿樸夏苓湯降脂、抗NAFLD的作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)6~8周C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18~20 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018?0002。雄性SPF級(jí)C57BL/6J背景FXR基因敲除小鼠，6~8周，購于南模生物（批號(hào)：NM?KO?190328）。

1.2 藥品與試劑

廣藿香醇（批號(hào)：HY?N0207）、厚樸酚（批號(hào)：HY?N0163）、和厚樸酚（批號(hào)：HY?N 0003）、乙酰澤瀉醇A（批號(hào)：HY?N 0853A）、乙酰澤瀉醇B（批號(hào)：HY?N 0805）、茯苓酸（批號(hào)：HY?N0371）、苦杏仁苷（批號(hào)：HY?N0190）、琥珀酸（批號(hào)：HY?N0420）、甘油三油酸酯（批號(hào)：HY?N1981）、油酸（OA，批號(hào)：HY?N1446）、棕櫚酸（PA，批號(hào)：HY?N0830）、奧貝膽酸（OCA，F(xiàn)XR陽性激動(dòng)劑，批號(hào)：HY?12222）等對(duì)照品，均來源于美國MedChemExpress科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商；HEK293T細(xì)胞株（批號(hào)：bio?72947），中國微生物菌種與細(xì)胞庫中心；pCD‐NA3.1?hFXR和pCDNA3.1?BSEP?luc質(zhì)粒由中山大學(xué)黃民教授饋贈(zèng)；FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)：E2691）、pCDNA3.1（批 號(hào)：E1751）和pGL3?CMV Renilla（批號(hào)：E2231），美國Promega公司；三酰甘油（TG）測定試劑盒（批號(hào)：A110?1?1），中國南京建成生物工程研究所；熒光探針DCFH?DA活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號(hào)：A110?1?1），碧云天生物技術(shù)有限公司；PureLink?FFPE總RNA提取試劑盒（批號(hào)：K156002）、SuperScript?雙鏈cDNA合成試劑盒（批號(hào)：11917010），TaqMan?Gene Expression Mas‐ter Mix的real?time PCR反應(yīng)液（批號(hào)：20200411）、小鼠TaqMan PCR探針、FXR探針（批號(hào)Mm004845 23_m1）、SHP探針（批號(hào)：Mm00442278_m1）、BSEP探針（Mm00445168_m1）、FASN探針（Mm00662319_m1）、CD36探針（Mm00432403_m1）、FABP1探針（Mm00444340_m1）和GAPDH探針（批號(hào)：Mm 99999915_g1），均購于美國Thermal?Fisher公司；FXR抗體（批號(hào)：ab129089），英國Abcam公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Enspire plus多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；BT3000全自動(dòng)生化分析儀（意大利愛康公司）；BDU?700核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司）；StepOne Plus Real?time熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國ABⅠ公司）；BX53奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離

按照LⅠU等[9]報(bào)道的方法，采用膠原酶消化肝組織法分離C57BL/6J野生型小鼠和FXR敲除小鼠原代肝細(xì)胞（MPH）。具體操作步驟：小鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后，75%（φ）乙醇皮膚消毒，打開腹腔，分離下腔靜脈，插管，立即注入1 mL肝素（100 U）。采用37℃的KrebsRinger灌流液Ⅰ（1 mmol/L NaHCO3、50 mmol/Lglucose、10 mmol/L NaCl、1 mol/L HEPES（p H7.45）、48 mmol/L KCl、12 mmol/L KH2PO4、12 mmol/L MgSO4和5 mmol/L EGTA）按20 mL/min流速進(jìn)行肝臟灌注50 mL灌流液Ⅰ，灌入的同時(shí)剪開門靜脈。隨后采用含0.5 g/L膠原酶ⅠⅠ的灌流液Ⅱ（1 mmol/L NaHCO3、50 mmol/L glucose、10 mmol/L NaCl、1 mol/L HEPES（p H7.45）、48 mmol/L KCl、12 mmol/L KH2PO4、12 mmol/LMgSO4和1 mmol/L CaCl2）進(jìn)行灌流約10 min至肝臟軟塌出現(xiàn)皸裂。剪下肝臟放置培養(yǎng)皿中，加入20 mL培養(yǎng)基，撕裂肝臟，形成肝細(xì)胞混懸液，細(xì)胞液用70μm細(xì)胞網(wǎng)濾過，收集濾液，50 g，離心3 min，棄上清，然后加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基混懸。臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（＞80%活細(xì)胞數(shù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。接種細(xì)胞，4 h后換液培養(yǎng)，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

MPH和HEK293T細(xì)胞在37℃的5%（φ）CO2培養(yǎng)箱里，使用10%（φ）FBS、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。MPH細(xì)胞按1×106種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組（DMSO）、模型組、廣藿香醇低、中、高劑量組（5、10、20μmol/L）和OCA組（10μmol/L）。模型組采用OA+PA（體積比2∶1，1 mmol/L）誘導(dǎo)24 h模擬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積蓄模型，對(duì)照組給予相應(yīng)的生理鹽水。各組細(xì)胞預(yù)先給予相應(yīng)藥物作用24 h后，隨后加入OA+PA誘導(dǎo)24 h。

2.3 雙熒光素酶分析

HEK293T細(xì)胞按5×104種于24孔板中，貼壁后，細(xì)胞采用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCD‐NA3.1（500 ng/孔，對(duì) 照 質(zhì) 粒）、pCDNA3.1?hFXR（500 ng/孔）、pCDNA3.1?BSEP?luc（1 000 ng/孔）和pGL3?CMV Renilla熒光素酶質(zhì)粒（100 ng/孔）12 h，然后加入10μmol/L相應(yīng)藥物（OCA、廣藿香醇、和厚樸酚、厚樸酚、乙酰澤瀉醇A/B、茯苓酸、苦杏仁苷、琥珀酸、甘油三油酸酯等）治療24 h后，對(duì)照組給予DMSO作為溶劑對(duì)照，采用Enspire plus多功能酶標(biāo)儀，按照Promega雙熒光素酶報(bào)告檢測的方法，測定各組藥物對(duì)BSEP?luc熒光素酶活性的影響。

2.4 免疫熒光分析

MPH按1×104種于24孔板中，廣藿香醇低、中、高劑量和OCA治療24 h后，PBS沖洗2次，10%（φ）多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，0.5%Triton X?100/PBS通透10 min，PBS沖洗3次，5%BSA封閉30 min，F(xiàn)XRⅠ抗（1∶200）4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，加入FⅠTC熒光2抗，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗3次，0.5μg/mL DAPⅠ染核5 min，PBS沖洗3次后，鏡檢。

2.5 ROS測定

MPH按1×104種于24孔板中，依次加入廣藿香醇、OA+PA分別治療24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入DCFH?DA熒光探針孵育4 h，按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，置于BX53奧林巴斯熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 MPH細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量測定

MPH細(xì)胞采用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，60%（φ）異丙醇分化3 min，加入新鮮配置的油紅O染色液染色20 min，PBS沖洗3次，蘇木素染核30 s，PBS沖洗5次，置于顯微鏡下觀察并拍照。并將各組細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞，按照TG檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.7 Real?time PCR測定細(xì)胞中FXR信號(hào)和脂質(zhì)合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

MPH細(xì)胞采用PBS沖洗2次，經(jīng)Trizol試劑提取、純化總mRNA、cDNA逆轉(zhuǎn)錄等步驟后，采用StepOne Plus Real?time熒光實(shí)時(shí)定量qPCR儀測定細(xì)胞中FXR、SHP、BSEP、FASN、CD36和FABP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。Real?time PCR反應(yīng)體系：cDNA模板5μL，TaqMan探針1μL，ddH2O 4μL，TaqMan Fast Advanced Master Mix 10μL，總體積20μL。擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃5 s、60℃30 s測定，40個(gè)循環(huán)。記錄各組樣品Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果以表示，用Stata11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藿樸夏苓湯成分廣藿香醇對(duì)FXR信號(hào)的影響

為篩選激動(dòng)FXR的成分，本研究對(duì)藿樸夏苓湯中代表性化學(xué)成分進(jìn)行了BSEP?luc熒光素酶報(bào)告基因活性分析。如圖1所示，與對(duì)照組比較，陽性對(duì)照藥OCA、廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B顯著提高BSEP?luc熒光素酶報(bào)告基因活性，結(jié)果提示廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B可激動(dòng)FXR信號(hào)。

圖1 藿樸夏苓湯成分廣藿香醇對(duì)FXR信號(hào)的作用Figure 1 Patchoulialcohol activated FXRsignaling in MPH cells(±s，n=3)

考慮到廣藿香是藿樸夏苓湯方中的君藥，隨后的實(shí)驗(yàn)都采用廣藿香醇作為研究對(duì)象。與熒光素酶活性測定結(jié)果一致，與對(duì)照組比較，免疫熒光分析顯示廣藿香醇和OCA可提高M(jìn)PH細(xì)胞內(nèi)FXR的蛋白水平，并促進(jìn)FXR入核作用。此外，與對(duì)照組比較，廣藿香醇中、高劑量組可顯著提高FXR及其下游靶基因SHP和BSEP的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

以上結(jié)果提示廣藿香醇可激動(dòng)FXR信號(hào)，可能是藿樸夏苓湯發(fā)揮降脂、抗NAFLD作用的關(guān)鍵成分之一。

3.2 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞脂質(zhì)水平的影響

與對(duì)照組比較，油紅O染色實(shí)驗(yàn)顯示，模型組中MPH細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和TG水平明顯增加，表明OA+PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積增加。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組均可明顯降低細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和細(xì)胞內(nèi)TG水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，廣藿香醇可顯著降低OA+PA誘導(dǎo)的MPH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用。結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集的影響（油紅O染色，200×）Figure 2 Patchoulialcohol decreased OA+PA?induced lipid accumulation in MPH cells（200×）

圖3 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響Figure 3 Patchouli alcohol reduced OA+PA?induced TG level in MPH cells(±s，n=3)

3.3 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞ROS形成的影響

結(jié)果見圖4。與對(duì)照組比較，模型組中MPH細(xì)胞內(nèi)DCFH?DA熒光探針?biāo)矫黠@增加，表明OA+PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS形成。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組均可明顯降低細(xì)胞內(nèi)DCFH?DA熒光探針?biāo)?。結(jié)果表明，廣藿香醇可顯著降低OA+PA誘導(dǎo)的MPH細(xì)胞內(nèi)ROS形成作用。

圖4 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集的影響Figure 4 Patchoulialcohol mitigated OA+PA?induced ROSgeneration in MPH cells（200×）

3.4 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞FXR信號(hào)和脂質(zhì)合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見圖5。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)FXR、SHP和BSEP的mRNA表達(dá)顯著降低，而脂質(zhì)合成基因FASN、CD36和FABP1的mRNA表達(dá)則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組可顯著提高OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞內(nèi)FXR信號(hào)（FXR、SHP和BSEP）的mRNA表達(dá)，而抑制脂質(zhì)合成基因（FASN、CD36和FABP1）的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，廣藿香醇可提高FXR信號(hào)，進(jìn)而抑制OA+PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成作用。

圖5 廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞內(nèi)FXR信號(hào)和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of patchouli alcohol on the mRNA expression level of FXR signaling and lipid synthesis genes in MPH cells induced by OA+PA(±s，n=3)

3.5 FXR敲除后，廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)FXR敲除MPH細(xì)胞脂質(zhì)水平積蓄作用的影響

為了進(jìn)一步闡述廣藿香醇激動(dòng)FXR信號(hào)在降脂、抗NAFLD作用中的重要性，本研究進(jìn)行分離FXR基因敲除小鼠的MPH細(xì)胞。在野生型MPH中，與模型組比較，廣藿香醇高劑量組明顯降低細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集和細(xì)胞內(nèi)TG水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；相反，在FXR敲除MPH中，與模型組比較，廣藿香醇介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂滴積蓄和TG水平的降低作用則受到損害，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，廣藿香醇降低OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用依賴于FXR的激動(dòng)作用。結(jié)果見圖6和7。

圖6 FXR敲除后，廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴聚集的影響Figure 6 FXR deletion compromised patchouli alcohol?mediated the decrease of lipid accumulation induced by OA+PA in MPH knockout cells（200×）

3.6 FXR敲除后，廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)FXR敲除MPH脂質(zhì)合成相關(guān)基因的影響

圖7 FXR敲除后，廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)FXR敲除MPH細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響Figure 7 Effect of patchouli alcohol on TG level in FXR?deficient MPH cells induced by OA+PA(±s,n=3)

結(jié)果見圖8。在野生型MPH中，與模型組比較，廣藿香醇明顯提高FXR信號(hào)FXR、SHP和BSEP的mRNA表達(dá)，而抑制OA+PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成基因FASN、CD36和FABP1的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；相反，在FXR敲除MPH中，與模型組比較，廣藿香醇失去了脂質(zhì)合成基因的抑制作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，廣藿香醇降低OA+PA誘導(dǎo)的MPH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成基因的調(diào)控作用依賴于FXR的激動(dòng)作用。

圖8 FXR敲除后，廣藿香醇對(duì)OA+PA誘導(dǎo)FXR敲除MPH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成基因mRNA表達(dá)水平的影響Figure 8 The effect of patchouli alcohol on mRNA expression level of lipid synthesis genes in FXR?knockout MPH cells induced by OA+PA(±s，n=3)

4 討論

隨著肥胖及相關(guān)代謝綜合征全球化流行的趨勢下，我國NAFLD發(fā)病率逐年升高，已成為最常見的肝臟疾病之一。NAFLD患者肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝障礙，致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，造成肝內(nèi)脂肪變性、ROS形成，繼而發(fā)生肝細(xì)胞炎癥、胰島素抵抗等，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化的發(fā)生、發(fā)展。到目前為止，NAFLD發(fā)病機(jī)制還未完全清楚，臨床上也缺乏有效的治療藥物和措施。因此，該病嚴(yán)重威脅人們的健康，故開發(fā)研制針對(duì)NAFLD有效藥物具有必要性及緊迫性。

NAFLD致脂質(zhì)吸收增加，引起TG形成升高，而致肝脂肪變性，進(jìn)而損害肝臟功能[10]，因此，降低肝臟脂質(zhì)含量的策略可能成為防治NAFLD的重要措施[10?11]。脂質(zhì)合成/吸收紊亂主要由于肝臟核受體（如FXR、PPARα、LXR等）的功能紊亂，從而失去對(duì)參與肝細(xì)胞脂質(zhì)的合成/吸收等相關(guān)基因（合成基因FASN、SCD1、CD36、ACC、FATP1等）的作用調(diào)控[12?14]，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)合成/吸收紊亂。FASN是脂肪酸合成的關(guān)鍵限速酶，其活性或基因表達(dá)的增加可促進(jìn)脂質(zhì)合成，抑制FASN的表達(dá)則顯著降低肝臟脂質(zhì)沉積，發(fā)揮改善NAFLD作用。研究顯示NAFLD患者體內(nèi)FXR和BSEP基因表達(dá)降低，且FXR敲除小鼠，引起脂質(zhì)合成基因FASN、SCD1、ACC等表達(dá)升高，易于發(fā)生脂質(zhì)紊亂，表明FXR是防治NAFLD一個(gè)重要靶點(diǎn)[15?16]。相反，激動(dòng)肝臟FXR，進(jìn)而抑制FASN表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)肝脂滴聚集和大泡性脂肪變性特征，發(fā)揮抗NAFLD作用[17?18]，表明FXR激動(dòng)劑在防治NAFLD中意義重大。然而，目前臨床上涉及靶向FXR防治NAFLD的藥物僅限于OCA[19]。因此，開發(fā)低毒、有效的FXR激動(dòng)劑迫在眉睫。

藿樸夏苓湯組方源自《醫(yī)原》，方由廣藿香、厚樸（姜制）、半夏（制）、茯苓、杏仁、薏苡仁、白蔻仁、淡豆豉、澤瀉和通草組成，具有“理氣化濕、疏表和中”之功效，臨床用于濕溫初起，濕重于熱者，是臨床常用治濕之良劑，臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示良好的保肝、降脂、抗NAFLD作用[3?8]，但抗NAFLD藥理機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)不明。

考慮到FXR信號(hào)在NAFLD發(fā)病的重要性，本實(shí)驗(yàn)首先通過對(duì)方中的代表性成分如廣藿香醇（廣藿香的主要成分）、厚樸酚、和厚樸酚（厚樸的主要成分）、乙酰澤瀉醇A/B（澤瀉的主要成分）、茯苓酸（茯苓的主要成分）、苦杏仁苷（杏仁的主要成分）、琥珀酸（半夏的主要成分）、甘油三油酸酯（薏苡仁的主要成分）等，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因活性分析，篩選FXR激動(dòng)劑。與Meng和Lin等報(bào)道一致[20?21]，本研究結(jié)果顯示，廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B升高BSEP?luc熒光素酶報(bào)告基因活性，提高FXR蛋白表達(dá)和促進(jìn)FXR入核作用，加強(qiáng)FXR信號(hào)的mRNA表達(dá)，并抑制脂質(zhì)合成基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致降低了OA+PA誘導(dǎo)MPH細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積和ROS形成。FXR敲除實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)XR敲除后，廣藿香醇失去了對(duì)FXR信號(hào)的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致了損害廣藿香醇改善OA+PA誘導(dǎo)脂質(zhì)合成基因的抑制作用和改善MPH細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了廣藿香醇降脂作用主要是依賴于FXR的激動(dòng)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在MPH細(xì)胞水平上顯示藿樸夏苓湯成分廣藿香醇通過激動(dòng)FXR信號(hào)通路，抑制脂質(zhì)合成基因的表達(dá)，進(jìn)而改善OA+PA誘導(dǎo)的MPH細(xì)胞脂質(zhì)堆積和ROS形成的作用。