胡濤，劉渠，曾霞，梁生旺，王淑美，湯丹，張陸勇

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術研究中心，廣東 廣州 510006；4.廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006；5.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006）

參棗滴丸是本課題組在研的中藥復方新藥，由廣棗、丹參、人參、降香、蘇合香、冰片六味藥組成，具有理氣止痛、活血化瘀等功效。本品另辟蹊徑，以理氣止痛治標、活血化瘀達血脈通暢為本，標本兼治，可久服，不傷正氣，用于氣滯血瘀型胸痹，西醫(yī)病癥為冠心病。方中廣棗和丹參為君藥，其中廣棗具有行氣活血、養(yǎng)心、安神之功，多用于氣滯血瘀、胸痹作痛、心悸氣短、心神不安。從目前臨床上比較推崇的“雙心治療”法來看，廣棗不僅能夠行氣活血，治療生理學上的心臟病變，也具有養(yǎng)心安神功效，可對患者術后的心理進行輔助治療，從而達到雙心治療的效果。

廣棗中富含沒食子酸和有機酸，文獻報道沒食子酸可抑制心肌梗死后的心肌纖維化［1］，總有機酸對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用［2］，且廣棗中總黃酮具有抗心律失常作用、抗結(jié)腸癌細胞Caco?2增殖、抗氧化、抗炎［3?7］等藥理作用。2020年版《中國藥典》中將沒食子酸作為含量測定和薄層鑒別的指標成分，因此本文將沒食子酸作為參棗滴丸的含量測定指標，參考《中國藥典》2020年版一部制定了廣棗［8］45、丹參［8］1311、人參［8］8、蘇合香［8］172、冰片［8］615味藥的薄層鑒別方法和沒食子酸［8］45的含量測定方法，為參棗滴丸成品的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC?20AT島津高效液相色譜分析儀（日本島津株式會社）；SQP電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；ME104電子分析天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；KQ?300DZ超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；Linomat 5?卡瑪薄層半自動點樣儀（瑞士CAMAG公司）；默克硅膠G60板（德國默克有限公司）；青島海洋硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；黃海硅膠GF254板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

廣棗對照藥材（批號：121334?200401）、人參對照藥材（批號：120917?201712）、丹參對照藥材（批號：120923?201615）、蘇合香對照藥材（批號：120931?201804）、龍腦對照品（批號：110881?201709，質(zhì)量分數(shù)99.6%）、沒食子酸對照品（批號：110831?201906，質(zhì)量分數(shù)91.5%）、人參皂苷Rg1（批號：110703?201933，質(zhì)量分數(shù)92.4%）、人參皂苷Re（批號：110754?202028，質(zhì)量分數(shù)93.4%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704?201827，質(zhì)量分數(shù)91.2%）、肉桂 酸 對 照 品（批 號：110786?201604，質(zhì) 量 分 數(shù)98.8%）、丹參素鈉對照品（批號：110855?201915，質(zhì)量分數(shù)97.8%）均購于中國食品藥品檢定研究院；參棗滴丸中試樣品（批號20201011）、參棗滴丸中試滴丸成品樣品（批號：20201208、20201209、20201210）、參棗滴丸陰性樣品均為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 廣棗薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細，取粉末1 g，5 mL純化水溶解，15 mL乙酸乙酯萃取2次，合并上層溶液，蒸干，甲醇定容至1 mL，即得供試品溶液。取缺廣棗陰性滴丸1 g，同法制成參棗滴丸缺廣棗陰性供試品溶液。取廣棗對照藥材1 g，加70%（體積分數(shù)，下同）乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，5 mL純化水溶解，其余步驟同供試品溶液制備方法，得廣棗對照藥材溶液。取沒食子酸對照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。照《中國藥典》2020版［8］通則0502試驗，吸取上述溶液各2μL，點于默克G60板上，使點樣斑點成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?丙酮?甲酸，體積比7∶2∶1）中，展開，取出晾干，置雙槽展開缸中，以氨蒸氣為顯色劑，熏至黃色斑點清晰。供試品色譜中，供試品與對照藥材、對照品相同高度的位置上，顯相同黃色條帶斑點，缺廣棗陰性樣品無該條帶斑點，結(jié)果見圖1。

圖1 廣棗的薄層鑒別Figure 1 TLCidentification of Choerospondiatis Fructus

2.1.2丹參薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細，取粉末1 g，加純化水30 mL，超聲30 min，加濃鹽酸2滴，調(diào)pH小于2，20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并上層溶液，蒸干，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺丹參陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺丹參陰性供試品溶液。取丹參對照藥材1 g，加純化水30 mL，加熱回流30 min，加濃鹽酸2滴，調(diào)pH小于2，其余步驟同供試品溶液制備方法，得丹參對照藥材溶液。取丹參素鈉對照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。照《中國藥典》2020版［8］通則0502試驗，吸取供試品溶液和陰性溶液5μL、對照品和對照藥材溶液2μL，點于青島海洋G板上，使點樣斑點成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?丙酮?甲酸，體積比25∶10∶4）中，展開，取出，晾干，以氨蒸氣為顯色劑，熏蒸5 min，呈淡黃色條帶，105℃加熱5 min后，取出在紫外光燈（365 nm）下觀察，顯熒光條帶。供試品色譜中，供試品與對照藥材、對照品相同高度的位置上，顯相同黃色條帶或天藍色熒光條帶，缺丹參陰性樣品無該條帶斑點，結(jié)果見圖2。

圖2 丹參的薄層鑒別Figure 2 TLC identification of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizome

2.1.3 蘇合香薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細，取粉末1 g，加乙醚10 mL，超聲10 min，濾過，濾液揮干，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺蘇合香陰性樣品1 g，同供試品溶液方法制成參棗滴丸缺蘇合香陰性供試品溶液。取蘇合香對照藥材1 g，與供試品同法制備，得蘇合香對照藥材溶液。取肉桂酸對照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對照品溶液。照《中國藥典》2020版［8］通則0502試驗，吸取上述溶液，各2μL，點于黃海GF254板上，置于展開劑［石油醚（30~60℃）?正己烷?甲酸乙酯?甲酸，體積比10∶30∶15∶1］中，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下觀察。供試品色譜中，供試品與對照藥材和對照品相應的位置上，顯相同高度的暗斑，缺蘇合香陰性樣品無暗斑，結(jié)果見圖3。

圖3 蘇合香的薄層鑒別Figure 3 TLCidentification of Styrax

2.1.4 人參薄層鑒別[9]取參棗滴丸適量，研細，取粉末4 g，加純化水20 mL，超聲30 min，乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，棄去上層溶液，水飽和正丁醇提3次，每次20 mL，合并上層溶液，用1%NaOH堿水洗滌2次，每次20 mL，棄去下層，正丁醇飽和水萃取2次，每次20 mL，棄去下層，取上層蒸至1~2滴溶液，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺人參陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺人參陰性供試品溶液。取人參對照藥材1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加純化水20 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，其余步驟同供試品制備，得人參對照藥材溶液。取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rg1對照品，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的混合溶液，作為人參混標對照品溶液。照《中國藥典》2020版［8］通則0502試驗，吸取上述溶液各2μL，點于默克G60板上，使點樣斑點成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?乙酸乙酯?甲醇?水，體積比15∶40∶22∶10，10℃以下放置的下層溶液）中，展開，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下觀察。供試品色譜中，供試品與對照藥材和對照品相應位置上，顯相同磚紅色斑點或熒光斑點，缺人參陰性樣品無該斑點，結(jié)果見圖4。

圖4 人參的薄層鑒別Figure 4 TLC identification of Ginseng Radix et Rhizoma

2.1.5 冰片薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細，取粉末1 g，加乙醚10 mL，超聲10 min，濾過，濾液揮去乙醚，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺冰片陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺冰片陰性供試品溶液。取冰片對照品龍腦適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的作為對照品溶液。照《中國藥典》2020版[8]通則0502試驗，分別吸取上述溶液各2μL，點于青島海洋G板上，置于展開劑（乙酸乙酯?正己烷，體積比3∶7）中，展開，取出，取出，晾干，以1%香草醛硫酸液為顯色劑顯色，于105℃下加熱至各斑點清晰。供試品色譜中，與對照藥材相應的位置上，顯相同顏色的斑點，缺冰片陰性樣品無該斑點，結(jié)果見圖5。

圖5 冰片的薄層鑒別Figure 5 TLCidentification of Borneol

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用FeiniGe‐nXPeonyx AQ?C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，柱溫設為25℃，流動相：甲醇?0.3%冰乙酸（體積比1∶99）等度洗脫，檢測波長：270 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：10μL。

在上述色譜條件下，沒食子酸基本上可達到基線分離，分離度＞1.5。理論塔板數(shù)以沒食子酸峰計算應不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸14.53 mg，于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得儲備液。精密吸取儲備液1.0 mL于10 mL量瓶，稀釋10倍，為中間稀釋液。精密吸取中間稀釋液0.5 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為7.265μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量滴丸，研細，精密稱取l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按參棗滴丸的處方配比和工藝制備缺廣棗陰性對照樣品，按“2.2.3”項方法制備廣棗陰性供試品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 mL，按“2.2.1”項方法條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖6?？梢姡瑓椀瓮铔]食子酸測定供試品和沒食子酸對照品在對應的位置上，可以檢測相同的色譜峰，光譜吸收行為基本一致；同時，在參棗滴丸缺廣棗陰性樣品色譜圖與指標成分沒食子酸相對應位置上，未檢測到干擾成分，表明該方法專屬性良好。

圖6 沒食子酸對照品、參棗滴丸供試品及參棗滴丸廣棗陰性供試品HPLC色譜圖Figure 6 HPLC chromatograms of Gallic acid,Shenzao drip‐ping pills sample,Shenzao dripping pills Choerospondiatis Fructus negativesample

2.2.6 線性關系考察 精密稱定沒食子酸對照品10.34 mg，加甲醇定容至10 mL，搖勻，作為沒食子酸母液，精密吸取母液適量，甲醇稀釋定容，配得質(zhì)量濃度為0.437 5、2.068 0、6.204 0、10.340 0、12.408 0μg/mL的系列對照品溶液，進樣量為10μL，進行液相分析得峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、對照品峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析，得回歸方程Y=26 625X-5 813.3，r=0.999 9。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.437 5~12.408 0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.2”項沒食子酸對照品溶液1份，進樣量為10μL，進行液相分析，連續(xù)進樣6次，測定沒食子酸的峰面積，計算峰面積RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的峰面積RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取一份參棗滴丸中試樣品（批號20201011），按按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算峰面積RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的峰面積RSD值為0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 精密稱取同一批參棗滴丸中試樣品（批號20201011）共6份，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項條件進樣，記錄其峰面積，分別計算其質(zhì)量分數(shù)和RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的RSD值為0.76%，表明方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批參棗滴丸中試樣品（批號20201011）共6份，每份精密加等量的對照品溶液，按照“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項條件進樣，計算回收率，結(jié)果如表1。可見，6份供試品中沒食子酸的加樣回收率在95.32%~97.87%之間，RSD值為1.08%，表明方法準確度良好。

表1 參棗滴丸中試樣品沒食子酸加樣回收率性試驗結(jié)果Table 1 Recoveries of gallic acid in Shenzao dripping pills pilot finished product(n=6)

2.2.11 樣品質(zhì)量分數(shù)的測定 3批中試參棗滴丸（批號20201208、20201209、20201210，規(guī) 格2 g/袋）每批各取2份樣品，按照“2.2.1”項條件進樣，并計算樣品質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果測得3批樣品的質(zhì)量分數(shù)分別為337.21、360.45、339.27μg/袋，平均值為345.64μg/袋。

3 討論

本研究參考2020年版《中國藥典》［8］和文獻[9?10]，采用TLC法對參棗滴丸中五味藥材進行定性鑒別。對廣棗和丹參的薄層色譜研究過程中，發(fā)現(xiàn)點樣形狀呈點狀的分離效果較差，而成條帶狀的分離效果較好；丹參的定性鑒別參考《中國藥典》中復方丹參滴丸的薄層鑒別方法，并進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉與氨氣反應后的黃色斑點，經(jīng)105℃烘烤5 min后在紫外365 nm下熒光效果最強，因而確定該顯色條件。在蘇合香薄層色譜中，陰性樣品在紫外254 nm照射下未見暗斑，因樣品乙醚提取后，僅蘇合香中成分在紫外254 nm產(chǎn)生暗斑。在人參薄層鑒別中，萃取步驟較多，人參皂苷易在提取過程中損失，需對溶液進行充分振搖、靜置過夜或離心分離，以達到更好的提取效果。本研究前期對薄層展開溫度和不同廠家薄層板進行了考察，發(fā)現(xiàn)人參在4℃條件下薄層展開效果最好；煙臺黃海GF254板相比于默克G60和青島海洋硅膠G板，能夠更好地對肉桂酸干擾斑點進行分離，無需控溫。

采用HPLC法對沒食子酸進行測定，通過查閱2020年版《中國藥典》[8]和文獻[11?13]，比較了4種沒食子酸含量測定的前處理方法，考察不同濃度甲醇、不同提取方式、不同提取時間對沒食子酸的含量影響，發(fā)現(xiàn)相對于超聲提取、加熱回流0.5 h和50%甲醇提取，70%甲醇加熱回流提取1 h的前處理方法沒食子酸含量最高。最終采用70%甲醇加熱回流1 h為本品的前處理方法。

通過查閱2020年版《中國藥典》和文獻[14?15]，對降香進行了多次薄層展開試驗，但均未顯現(xiàn)特異性斑點，未能完成參棗滴丸中降香的薄層鑒別，后期考慮采用HPLC法對其質(zhì)量控制進行研究，以完善參棗滴丸的質(zhì)量控制體系。本研究作為初步的參棗滴丸質(zhì)量控制研究，將君藥廣棗作為滴丸質(zhì)量控制的一個重點，為臨床前研究的滴丸質(zhì)量控制提供依據(jù)，在后續(xù)研究中，將繼續(xù)對滴丸中人參、丹參等貴重藥材進行質(zhì)量控制，在滿足藥物療效的同時，對企業(yè)的質(zhì)量控制成本進行合理分析，以此確定最終的質(zhì)量控制標準。

本文通過對參棗滴丸的君藥廣棗進行定性和定量鑒別，并制定了參棗滴丸中丹參、人參、冰片和蘇合香薄層鑒別方法，質(zhì)量可控，分離度較好，重現(xiàn)性高，可以作為參棗滴丸的質(zhì)量控制標準，為參棗滴丸的制劑提供了質(zhì)量控制依據(jù)，為臨床用藥的有效性和合理性提供了質(zhì)量保障。