王少澤，魏順發(fā)，張偉

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南龍津康佑生物醫(yī)藥有限公司，云南 昆明 650503；3.昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 650503）

奧美沙坦酯氨氯地平片是日本一三共公司研制的作用于AGTR1（angiotensinⅡreceptor type?1）和VGCCS（voltage?gated calcium channel）靶點(diǎn)的抗高血壓復(fù)方制劑[1?2]。2007年9月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)并以商品名Azor?在美國(guó)上市，2009年1月歐盟上市，商品名為Sevikar?。2018年7月，上海一三共公司獲得中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)上市，商品名為“思衛(wèi)卡”。作為抗高血壓的一線用藥，該藥不僅對(duì)收縮壓的降壓作用強(qiáng)，且能夠改善患者血管活性物質(zhì)水平，安全可靠，具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值[3?5]。

目前，奧美沙坦酯氨氯地平片的主要規(guī)格有：每片含奧美沙坦酯40 mg、氨氯地平10 mg；每片含奧美沙坦酯20 mg、氨氯地平5 mg；國(guó)內(nèi)在售的主要規(guī)格是每片含奧美沙坦酯20 mg、氨氯地平5 mg[6]。2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，片劑中每片標(biāo)示量≤25 mg或主藥含量占片重的百分比≤25%，應(yīng)依照規(guī)定對(duì)其含量均勻度進(jìn)行檢測(cè)[7]?！睹绹?guó)藥典》第43版采用HPLC法進(jìn)行奧美沙坦酯氨氯地平片的含量和含量均勻度測(cè)定，測(cè)定時(shí)需將進(jìn)樣器溫度設(shè)為5℃，對(duì)儀器性能要求高，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)[8]。另外，國(guó)外有學(xué)者采用超高效液相色譜儀使該復(fù)方制劑的含量測(cè)定時(shí)間縮短，但操作繁瑣、檢測(cè)成本高[9]。本研究擬采用UV法對(duì)奧美沙坦酯氨氯地平片的含量均勻度進(jìn)行測(cè)定，以期開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法[10]。

1 儀器與試藥

Thermo Evolution 350紫外/可見分光光度計(jì)；Shimadazu UV?2700紫外/可見分光光度計(jì)；Agilent 1260型高效液相色譜儀；Sartorius SQP型天平；SK8200GR型超聲波清洗器。

奧美沙坦酯氨氯地平片（規(guī)格：每片含奧美沙 坦酯20 mg、氨氯地平5 mg，批號(hào)：20201028、20201128?2、20201224）和空白輔料（規(guī)格：每片含空白輔料80 mg，批號(hào)：20200928）均由云南龍津康佑生物醫(yī)藥有限公司提供；奧美沙坦酯對(duì)照品（批號(hào)：100864?201904）和苯磺酸氨氯地平對(duì)照品（批號(hào)：100374?201605）均由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供；聚四氟乙烯濾膜（天津市圣信唯科技有限公司，規(guī)格0.45μm）；尼龍濾膜（規(guī)格0.45μm）和聚醚砜濾膜（規(guī)格0.45μm）均由天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供；乙腈（AR級(jí)），水（自制）。

2 方法及結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密稱取40 mg奧美沙坦酯對(duì)照品和28 mg苯磺酸氨氯地平對(duì)照品（以氨氯地平計(jì)為20 mg），加稀釋劑（乙腈?水，體積比為1∶1）適量，溶解并稀釋制成奧美沙坦酯質(zhì)量濃度為20μg/mL和氨氯地平為10μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密稱取80 mg的空白輔料置50 mL量瓶中，用聚四氟乙烯膜過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加稀釋劑定容，搖勻，過濾，取用續(xù)濾液，即得空白輔料溶液。取上述溶液在190~500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 UV全波長(zhǎng)掃描圖Figure 1 UV full?wavelength scan

可見，奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯地平分別在260 nm和360 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，空白輔料在260 nm波長(zhǎng)附近對(duì)奧美沙坦酯吸光度略有干擾，而在波長(zhǎng)285 nm處空白輔料和空白溶劑無明顯干擾，故將奧美沙坦酯的測(cè)定波長(zhǎng)定為285 nm，苯磺酸氨氯地平的測(cè)定波長(zhǎng)定于無任何干擾的360 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱定奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯地平（以氨氯地平計(jì)）對(duì)照品適量，加稀釋劑制成含80μg/mL奧美沙坦酯和20μg/mL氨氯地平的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10片，分別放入50 mL量瓶中，加稀釋劑35 mL，超聲（500 W、35 kHz）25 min，放冷至室溫，加稀釋劑定容，搖勻，用聚四氟乙烯膜過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加稀釋劑定容，搖勻，即得供試品溶液。過濾，取用續(xù)濾液。

2.3 測(cè)定原理

由于本公司生產(chǎn)的奧美沙坦酯氨氯地平片處方中的2個(gè)原料藥分別是奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯地平。計(jì)算奧美沙坦酯和氨氯地平的含量時(shí)，需先測(cè)出奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯地平的吸光度，再按照對(duì)照品比較法計(jì)算奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯地平的濃度。其中，測(cè)得的苯磺酸氨氯地平的濃度需乘以氨氯地平與苯磺酸氨氯地平的相對(duì)分子質(zhì)量比值才是氨氯地平的濃度。在分別測(cè)定奧美沙坦酯和苯磺酸氨氯平對(duì)照品溶液時(shí)發(fā)現(xiàn)：奧美沙坦酯在285 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.55，360 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為-0.002；苯磺酸氨氯地平在285 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.02，在360 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.33。由此推算，奧美沙坦酯在360 nm波長(zhǎng)處含量占氨氯地平含量＜2%，對(duì)測(cè)定氨氯地平含量結(jié)果影響可忽略不計(jì)。但氨氯地平在285 nm波長(zhǎng)處占奧美沙坦酯含量已超過2%，對(duì)測(cè)定奧美沙坦酯含量結(jié)果的影響不可忽略。按以下推導(dǎo)公式計(jì)算苯磺酸氨氯地平和奧美沙坦酯的濃度：

將上述測(cè)得的苯磺酸氨氯地平和奧美沙坦酯的濃度分別代入下列公式1和公式2中，即可分別計(jì)算出氨氯地平和奧美沙坦酯的含量：

式中：V為稀釋體積250 mL；M1為氨氯地平相對(duì)分子質(zhì)量408.9；M2為苯磺酸氨氯地平相對(duì)分子質(zhì)量567.1；W1為氨氯地平標(biāo)示量5 mg；W2為奧美沙坦酯標(biāo)示量20 mg。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.1 氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品28.14 mg（以氨氯地平計(jì)為20.29 mg），用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL含氨氯地平202.90μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用稀釋劑稀釋分別制成每1 mL含氨氯地平12.17、16.23、20.29、24.35、32.46μg的系列對(duì)照品溶液，在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以濃度（CAML）為橫坐標(biāo)、吸光度（AAML）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程AAML=0.016 2CAML+0.003 2，rAML=0.999 5，表明氨氯地平在12.17~32.46μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 奧美沙坦酯標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取奧美沙坦酯對(duì)照品40.19 mg，用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL含奧美沙坦酯803.80μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用稀釋劑稀釋分別制成每1 mL含奧美沙坦酯48.23、64.30、80.38、96.46、128.61μg的系列對(duì)照品溶液，在285 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以濃度（COLM）為橫坐標(biāo)、吸光度（AOLM）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為AOLM=0.006 7COLM+0.007，rOLM=0.999 9，表明奧美沙坦酯質(zhì)量濃度在48.23~128.61μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取奧美沙坦酯對(duì)照品400 mg、苯磺酸氨氯地平對(duì)照品140 mg（以氨氯地平計(jì)約含100 mg）置100 mL量瓶中，加稀釋劑超聲溶解，并加稀釋劑定容至刻度。即得每1 mL分別含奧美沙坦酯4 mg和氨氯地平1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

取9個(gè)50 mL量瓶，每份容量瓶中精密稱取80 mg空白輔料。并按“2.2.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液濃度的70%、100%、130%分別移取上述儲(chǔ)備液3.5、5、6.5 mL置含80 mg空白輔料的50 mL量瓶中，加稀釋劑至容量瓶體積的70%，超聲25 min，超聲結(jié)束后稀釋定容搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中加稀釋劑定容，搖勻，過濾，棄去2~3 mL，取用續(xù)濾液，每個(gè)濃度平行制備3份，即得9份待測(cè)液[11]。將上述待測(cè)溶液于285 nm與360 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描測(cè)定。將測(cè)得的吸光度值代入“2.3”項(xiàng)推導(dǎo)公式中，可得到待測(cè)溶液中奧美沙坦酯與氨氯地平的濃度，從而分別求出奧美沙坦酯與氨氯地平的回收率。結(jié)果測(cè)得2種成分的回收率均在98%~102%范圍內(nèi)，RSD值＜2%，表明空白輔料對(duì)2個(gè)主成分的檢測(cè)幾乎無干擾，見表1、表2。

表1 奧美沙坦酯回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of olmesartan medoxomil recovery test

表2 氨氯地平回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of amlodipine recovery rate

2.6 精密度試驗(yàn)

取1份供試品溶液分別在360 nm和285 nm波長(zhǎng)處掃描6次，結(jié)果顯示苯磺酸氨氯地平在360 nm波長(zhǎng)處吸光度分別為0.330 2、0.330 2、0.330 3、0.330 3、0.330 5、0.330 7，RSD值為0.06%；奧美沙坦酯在285 nm波長(zhǎng)處吸光度分別為0.566 3、0.566 7、0.567 8、0.568 3、0.568 6、0.568 4，RSD值為0.16%，表明儀器精密度符合要求。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：20201224），分別在Thermo Evolution 350紫外/可見分光光度計(jì)、Shimadazu UV?2700紫外/可見分光光度計(jì)上，使用不同的分析人員進(jìn)行測(cè)試。其中Thermo Evolution350紫外/可見分光光度計(jì)上測(cè)得奧美沙坦酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為101.08%，A+2.2S為3.94，氨氯地平平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.70%，A+2.2S為0.86。Shimadazu UV?2700紫外/可見分光光度計(jì)上測(cè)得奧美沙坦酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.40%，A+2.2S為7.13，氨氯地平平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.97%，A+2.2S為4.99，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1份供試品溶液，避光條件下室溫放置0、2、4、6、8 h，于285 nm與360 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描測(cè)定，結(jié)果測(cè)得奧美沙坦酯在285 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.569 9、0.570 3、0.586 4、0.579 8、0.576 9，RSD值為1.07%；苯磺酸氨氯地平吸光度在360 nm波長(zhǎng)處為0.320 5、0.322 6、0.333 8、0.326 0、0.326 7，RSD值為1.55%，表明供試品溶液在避光條件下室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 含量均勻度測(cè)定結(jié)果

按“2.2”項(xiàng)方法配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品含量均勻度測(cè)定，另參照《美國(guó)藥典》第43版中奧美沙坦酯氨氯地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中HPLC法含量均勻度測(cè)定相同3批奧美沙坦酯氨氯地平片的含量均勻度，結(jié)果見表3?？梢?，本文所建立的UV法與HPLC法測(cè)定的奧美沙坦酯氨氯地平片的含量均勻度結(jié)果基本一致。

表3 奧美沙坦酯氨氯地平片的含量均勻度測(cè)定結(jié)果Table 3 Determine result of the content uniformity of amlodipine and olmesartan medoxomil tablets

3 討論

3.1 供試品濃度的選擇

本研究選擇的供試品測(cè)定濃度為含氨氯地平20μg/mL、奧美沙坦酯80μg/mL，結(jié)果顯示苯磺酸氨氯地平在360 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.33，奧美沙坦酯在285 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.55，吸光度值均落在2020年版《中國(guó)藥典》推薦的0.3~0.7范圍內(nèi)，且符合朗勃?比爾定律[12]。

3.2 稀釋劑的選擇

有文獻(xiàn)報(bào)道，在測(cè)定奧美沙坦酯氨氯地平片含量時(shí)，用乙腈與水混合進(jìn)行溶解[13]，故本研究嘗試選用乙腈?水（體積比1∶1）作為稀釋劑，結(jié)果顯示供試品溶解良好。

3.3 超聲時(shí)間的考察

取同批樣品30片，考察在不同超聲（500 W、35 kHz）時(shí)間（5、25、45 min）下的含量均勻度，超聲時(shí)應(yīng)注意采用水循環(huán)或者加冰塊的方式防止溶液溫度過高從而導(dǎo)致主成分降解。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)超聲時(shí)間點(diǎn)奧美沙坦酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.45%、103.48%、99.61%，氨氯地平的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.84%、105.01%、101.61%，測(cè)得結(jié)果均在93.0%~107.0%范圍內(nèi)，且A+2.2S≤15.0。根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，片劑的含量在（100.0±7.0）%范圍是包含了檢測(cè)誤差的，本次測(cè)試復(fù)方制劑的各有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在此規(guī)定范圍內(nèi)，多次測(cè)定值之間的差值可以酌情放寬至5%。結(jié)合《美國(guó)藥典》在測(cè)試該藥含量時(shí)超聲時(shí)間選擇25 min，本研究選擇超聲時(shí)間為25 min也是可行的。

3.4 濾膜的篩選

分別用離心及聚四氟乙烯、尼龍、聚醚砜濾膜過濾的方式，對(duì)供試品溶液進(jìn)行前處理，并于檢測(cè)波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度測(cè)定，結(jié)果測(cè)得離心及3種濾膜在360 nm波長(zhǎng)處苯磺酸氨氯地平的吸光度分別為0.336 5、0.331 8、0.335 4、0.338 3，在285 nm奧美沙坦酯波長(zhǎng)處的吸光度分別為0.568 3、0.562 4、0.563 1、0.609 0?？梢娋鬯姆蚁⒛猃垶V膜與離心幾乎無差別，但聚醚砜濾膜與離心相差較大?？紤]聚四氟乙烯濾膜所用材質(zhì)穩(wěn)定，本研究選用聚四氟乙烯濾膜。

本研究不足之處在于苯磺酸氨氯地平對(duì)照品溶液在285 nm波長(zhǎng)處的吸光度過低（約為0.02），測(cè)定吸光度時(shí)受干擾因素較多。因此，平行制備的2份對(duì)照品溶液在此處響應(yīng)因子（吸光度/濃度）比值很難達(dá)到98%~102%范圍內(nèi)，導(dǎo)致奧美沙坦酯的含量測(cè)定結(jié)果誤差較大。本文選擇將2份苯磺酸氨氯地平對(duì)照品溶液的285 nm波長(zhǎng)處響應(yīng)因子取平均值的方式代入“2.3”推導(dǎo)公式中來降低誤差。