孫悅萍，周 芹，徐利劍，任紅波，馬文瓊，張曉波，金海濤，陳國峰，劉 峰，董見南

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱 150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

氯蟲苯甲酰胺，是一種具有廣譜安全等優(yōu)勢的新型結(jié)構(gòu)鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑，對鱗翅目等害蟲的防治效果顯著，其作用于昆蟲的機(jī)體功能，致使昆蟲饑餓和死亡[1-2]。噻蟲胺，是一種具有毒性低、長持效期、無交互抗性等優(yōu)勢的新煙堿類殺蟲劑，有較好的內(nèi)吸性、選擇性和滲透性，其作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，致使昆蟲麻痹和死亡[3-4]。水稻是中國主要的糧食作物，為提高產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，減少病蟲草害及環(huán)境污染等，合理選用低毒高效的農(nóng)藥成為選擇之一，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的復(fù)配使用能夠有效防治水稻上的二化螟和稻飛虱。

隨著氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的大面積使用，兩者在作物中的殘留及對環(huán)境的安全性備受關(guān)注。歐盟已規(guī)定氯蟲苯甲酰胺在糙米中的農(nóng)藥殘留最大限量(MRL)值為0.4mg/kg，國際食品法典委員會(CAC)規(guī)定在谷物中的MRL值為0.02mg/kg[5]，中國GB 2763—2021中規(guī)定稻谷中氯蟲苯甲酰胺及噻蟲胺MRL值均為0.5mg/kg[6]，其中前者為臨時限量，但是還沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。所以建立稻谷中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的測定方法迫在眉睫。

目前，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺分析方法主要包括氣相色譜法(GC-ECD)[7]、液相色譜法(HPLC)[8-9]及其液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-11]和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS/MS)等[12]。前處理凈化方法主要有液液萃取[13]、固相萃取(SPE)[14]和基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)(QuEChERS)[15-16]方法。宋文芳利用高效液相色譜法研究辣椒中氯蟲苯甲酰胺的殘留量[9]，高效液相色譜具有普遍的選擇性，但是其前處理過程較復(fù)雜，且靈敏度較低。馮柳娟利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)研究大豆中氯蟲苯甲酰胺的殘留量[12]，但是此方法分析檢測耗時過長，與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜比較前處理也過于復(fù)雜[8]。目前，對一些復(fù)雜基質(zhì)的前處理，QuEChERS法應(yīng)用較為廣泛，而且凈化效果也十分突出。選用QuEChERS法-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定糙米、稻殼及秸稈中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的殘留檢測分析技術(shù)未見報道。擬建立的檢測分析方法補(bǔ)充了這一領(lǐng)域的研究空白。本文優(yōu)化了QuEChERS前處理方法中的提取溶劑及凈化方法，考察了方法的線性關(guān)系、檢出限、精密度及準(zhǔn)確度，建立的方法滿足農(nóng)藥殘留分析要求，為在水稻上復(fù)配使用氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺提供相關(guān)可信的試驗數(shù)據(jù)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯蟲苯甲酰胺（純度99%，上海市農(nóng)藥研究所）；噻蟲胺（純度98.2%，沈陽化工研究院）。乙腈、甲酸（色譜純）；N-丙基乙二胺（PSA，40～60mesh，艾杰爾公司）；十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm，艾杰爾公司）；石墨化炭黑（GCB，120-400Mesh，艾杰爾公司）；有機(jī)系濾膜（尼龍，0.22μm，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

美國Waters Xevo TQ-S液相色譜/三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；梅特勒電子天平；日本日立冷凍高速離心機(jī)；德國艾卡往復(fù)式振蕩器。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取 稱取樣品（糙米10.0 g，稻殼2.0 g，秸稈2.0 g），依次加入20m L蒸餾水、20m L乙腈，混勻后振蕩提取30m in，收集提取液，加入5 g氯化鈉，渦旋3min，以5000 r/m in離心3m in，上清液待凈化。

1.3.2 凈化 分別吸取1m L糙米、稻殼和秸稈的上層待凈化液，糙米待凈化液中加入25mg C18，稻殼和秸稈待凈化液中分別加入50 mg PSA，渦旋1 min，以10000 r/m in離心3m in，過0.22μm有機(jī)系濾膜，待液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀測定分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐步稀釋配制成0.1、1、10、20、100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐步稀釋配制成0.1、1、10、100、200、500 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流圖（圖1）。

圖1 氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流圖(0.1mg/L)

1.5 儀器條件

1.5.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC? C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；進(jìn)樣體積：2μL；流動相：乙腈（色譜），0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.5.2 質(zhì)譜分析條件 電噴霧正離子掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度150℃，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 檢測限、定量限和添加回收率的測定

農(nóng)藥殘留分析中的檢測限是利用3倍的信噪比(S/N)來確定的，利用10倍的信噪比作為方法的定量限。為了確定氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的檢測限，分別將氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1.0m L)逐漸稀釋，直到氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的S/N比為3。

糙米、稻殼、秸稈中的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺定量限的確定，將0.01mg/L氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的工作溶液加標(biāo)至糙米、稻殼和秸稈中，按照1.3中描述的方法進(jìn)行提取、凈化和分析，逐級稀釋直至氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的S/N比為10。

分別在空白糙米、稻殼和秸稈樣品中添加3組濃度的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組添加濃度重復(fù)5平行，按1.3試驗方法處理各組回收樣品，按1.5測定分析后，計算各組回收樣品的平均回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中，最常用的提取溶劑包括甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯等，根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)選擇合適的提取溶劑，利用“相似相溶”的原則，選擇能夠溶解目標(biāo)化合物最大或者最合適的溶劑。一般情況下，對于極性較小的農(nóng)藥，可以選用正己烷、石油醚等，極性稍強(qiáng)的農(nóng)藥通常選擇極性溶劑或者含水溶劑，如甲醇、乙腈等。

本實驗中選擇最常用的甲醇和乙腈作為提取溶劑，分別考察了兩種溶劑的提取效果。使用氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至空白的糙米、稻殼、秸稈樣品中，使得上述3種基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的含量均為0.1mg/kg。如圖2所示，使用甲醇對氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的提取率在68.7%～88.4%之間，50%乙腈水的提取率在97.6%～99.7%之間，純乙腈對氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的提取率在86.4%～91.6%之間。因此，50%乙腈水是提取糙米、稻殼和秸稈中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的最佳溶劑。

圖2 提取溶劑對氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺提取率的影響

2.2 凈化方法的選擇

在糙米(10.0 g)、稻殼(2.0 g)、秸稈樣品(2.0 g)中加入氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使糙米、稻殼和秸稈空白樣品中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的濃度均為0.1mg/kg，根據(jù)2.1中選用的提取溶劑先后加入20m L的蒸餾水和20m L的分析純乙腈提取氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺，振蕩提取30m in后，在上述的提取液中加入5 g NaCl，振蕩鹽析后取1m L的上層有機(jī)相。在該提取溶劑中分別加入25、50、75和100mg的PSA、C18和GCB來確定最佳的凈化劑和種類和使用量。結(jié)果表明，當(dāng)使用25～100mg的GCB來凈化糙米、稻殼和秸稈的1m L提取液時，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺在糙米中的回收率在38.4%到88.4%之間，在稻殼中的回收率低于81.6%，而在秸稈中的回收率則為48.2%～87.4%，且隨著GCB使用量的增大，其回收率逐漸降低。而當(dāng)使用25～100mg PSA來凈化糙米、稻殼和秸稈的1m L提取液結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用75mg的PSA凈化糙米提取液時，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的回收率最高，分別為95.2%和94.7%，使用50mg PSA凈化稻殼和秸稈提取液時氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的回收率最高，在95.6%和99.4%之間。而當(dāng)使用25mg C18凈化糙米的提取液時糙米中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的回收率為96.8%～99.6%，而當(dāng)C18使用量逐漸增加時，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的回收率逐漸降低，均低于88.4%。由此結(jié)果可見過量的C18凈化劑能夠吸附提取液中的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺。在兼顧糙米、稻殼和秸稈中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的添加回收率和使用凈化劑的成本，在本方法中選擇50mg PSA凈化稻殼和秸稈中的雜質(zhì)，而選擇25mg C18凈化糙米中的雜質(zhì)（表3）。

表3 提取溶液中凈化劑PSA，C18和GCB的優(yōu)化

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性關(guān)系和檢出限 在1.5中的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下，分別測定氯蟲苯甲酰胺(0.1、1、10、20、100 μg/L)和噻蟲胺(0.1、1、10、20、100、500 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，獲得氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺定性離子對的峰面積。以氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，定性離子的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(y)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氯蟲苯甲酰胺在0.1～100μg/L線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y=25143x+13865，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9998；噻蟲胺胺在0.1～500μg/L線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y=3357x+7819，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9998。以3倍信噪比(S/N)計算，氯蟲苯甲酰胺的檢出限為2.95×10-5ng，噻蟲胺的檢出限為5.79×10-5ng。以低檔添加水平為準(zhǔn)，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺在糙米中的定量限均為0.005mg/kg，在稻殼和秸稈中的定量限均為0.025mg/kg（圖3）。

圖3 氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的線性關(guān)系

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺準(zhǔn)確度和精密度的測定采用的是添加回收的方法，在空白的糙米樣品中添加濃度為0.005、0.01和0.2mg/kg的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在空白的稻殼和秸稈樣品中添加濃度為0.025、0.05和1.0mg/kg的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度重復(fù)5次，并利用1.3和1.5中優(yōu)化的分析方法進(jìn)行前處理和測定。通過計算空白糙米、稻殼和秸稈中3個添加水平的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以回收率來確定該方法的準(zhǔn)確度，而RSD來衡量該方法的精密度。糙米、稻殼和秸稈中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。由測定結(jié)果可知，氯蟲苯甲酰胺在糙米、稻殼和秸稈樣品中的加標(biāo)平均回收率為92.2%～105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～10.1%之間；噻蟲胺的平均回收率為83.2%～98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.3%?；厥章屎途芏染鶟M足檢測水稻基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的方法要求。

表4 氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的添加回收率

3 討論與結(jié)論

目前對于同時測定水稻基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法并未見報道，僅有兩種農(nóng)藥單獨的檢測方法，而隨著氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的復(fù)配農(nóng)藥的生成和施用，能夠同時測定上述兩種農(nóng)藥的分析方法便顯得尤為重要。本文利用QuEChERS前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時測定氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺在水稻中的殘留分析方法，能夠滿足農(nóng)藥殘留檢測的需要。創(chuàng)新點在于建立的方法能夠適用于水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺農(nóng)藥殘留的同時測定，分析方法前處理操作簡單、節(jié)約了試驗成本。

對于提取溶劑的選擇，目前，常見的用于農(nóng)藥殘留的提取溶劑有丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈、乙酸乙酯等[17-18]，考慮到氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的在各種溶劑中的溶解度不同，本研究選用了純甲醇、50%乙腈和純乙腈來優(yōu)化提取溶劑，通過上述3種溶劑在糙米、稻殼和秸稈中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的提取效果，來確定最合適的提取溶劑。由于農(nóng)藥施用后部分農(nóng)藥通過滲透、吸收等方式進(jìn)入到植物體內(nèi)，因此這部分的農(nóng)藥需要在加水的情況下才能夠更好的被有機(jī)溶劑提取出來，因為在水存在的情況下能夠?qū)⒓?xì)胞進(jìn)行軟化，增加細(xì)胞的通透性，使得有機(jī)溶劑能夠有效的進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，從而能夠提高有機(jī)溶劑對植物體內(nèi)農(nóng)藥的提取效率[19]，因此選擇50%乙腈水作為氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的提取溶劑。對于凈化劑的選擇，在QuEChERS前處理方法中，最常用的材料包括PSA、GCB、C18等[20]。PSA能夠有效的吸附農(nóng)藥殘留提取溶劑中的糖類、有機(jī)酸以及脂肪酸等一些極性雜質(zhì)；C18吸附農(nóng)藥殘留提取液中脂質(zhì)、色素等一些非極性的雜質(zhì)；而GCB具有雙面性，最主要的凈化效果為吸附提取液中的色素等有色雜質(zhì)，但GCB對某些特殊的農(nóng)藥也有一定的吸附性[21-22]。對糙米而言，選用C18的凈化效果最好，且用量較低。在凈化劑PSA中存在兩個氨基，而這兩個氨基的結(jié)構(gòu)能夠有效的結(jié)合稻殼和秸稈中的糖類、有機(jī)酸、色素和脂肪酸等極性的雜質(zhì)，而且PSA可以較好的凈化稻殼和稻桿中的雜質(zhì)且對氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺沒有吸附的影響。本文建立的分析方法能夠同時準(zhǔn)確測定水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺殘留量，在提取方式上未進(jìn)行詳盡的比較試驗，且未建立土壤基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的前處理和檢測方法，應(yīng)在完善提取方式及在土壤中的殘留量做相應(yīng)方法的試驗。

氯蟲苯甲酰胺在0.1～100μg/L、噻蟲胺胺在0.1～500μg/L線性關(guān)系良好，在優(yōu)化條件的條件下氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺在糙米、稻殼和秸稈基質(zhì)中的平均回收率在83.2%～105.4%之間，變異系數(shù)為1.2%～10.1%，氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺的最低檢出限分別為2.95×10-5和5.79×10-5ng，在糙米基質(zhì)中的定量限為0.005mg/kg，在稻殼和秸稈中的定量限均為0.025mg/kg。本研究建立的分析方法能夠簡單準(zhǔn)確、快速有效的同時測定水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲苯甲酰胺和噻蟲胺，該方法完全能夠滿足農(nóng)藥殘留分析要求，適用于大量水稻樣品的快速檢測，為政府監(jiān)管提供有效的檢測分析手段。