郭巨先，吳廷全，李沐蓉，唐 康，姚春鵬，李桂花，羅文龍，王 瑞

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣州 510640；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣州 510640；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

0 引言

芋(Colocasia esculenta(L.)Schott)屬于天南星科，是一種重要的糧菜兼用作物，被稱為第五大根莖作物[1]，具有重要的食用和醫(yī)療價值，為世界范圍內(nèi)廣泛種植[2]。近年來，芋頭產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，芋頭資源的保護與利用研究也越來越受到重視。由于芋頭栽培品種大多為無性繁殖，各地引進交流頻繁，導(dǎo)致‘一種多名’或者‘一名多種’現(xiàn)象常見，但從表型難以準(zhǔn)確分類。因此利用基因組信息對芋頭種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析及構(gòu)建核心種質(zhì)資源對芋頭種質(zhì)資源的保護利用尤為重要。另外，種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，由于芋頭產(chǎn)值高，其栽培面積逐年擴大，而長期的無性繁殖導(dǎo)致芋頭疫病呈現(xiàn)逐年嚴(yán)重的趨勢，嚴(yán)重制約了芋頭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。目前已有報道的用于芋資源遺傳多樣性分析的研究分子標(biāo)記有RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP等[4-8]，IRW IN等[9]利用PAPD標(biāo)記將47個芋資源分為3大類群，發(fā)現(xiàn)亞洲品種與太平洋品種遺傳距離較遠(yuǎn)。KREIKE等[10]利用AFLP標(biāo)記對來自7個國家的255份芋頭資源進行多樣性分析，結(jié)果將其分為2大類，一類來自亞洲國家，另一類來自太平洋地區(qū)，且兩類材料遺傳距離較遠(yuǎn)；董紅霞等[11]利用ISSR標(biāo)記對72份芋種質(zhì)資源進行多樣性分析。在遺傳系數(shù)0.725處，將72份芋種質(zhì)資源聚為3大類，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記分類和形態(tài)學(xué)分類并不一致。胡侃等[12]利用SSR分子標(biāo)記對105份芋頭資源進行遺傳相似性分析，將105份芋頭資源劃分為六大類。王直新等[13]利用SNP標(biāo)記對二倍體芋資源進行遺傳多樣性分析，將69份芋資源分為5個類群。在芋頭抗性鑒定方面的研究目前國內(nèi)也僅有少量報道，周清平等[14]利用離體葉片人工接種病原菌孢子懸浮液的方法篩選到8個抗病品系，11個中抗品系，并認(rèn)為離體葉片接種法是一種簡潔快速鑒定芋頭疫病抗性的方法。莫俊杰等[15]采用離體葉片人工接種方法對芋資源進行疫病抗性鑒定同時采用SSR分子標(biāo)記方法進行多樣性分析，篩選到8個抗或中抗品系。但是由于SSR標(biāo)記有限，導(dǎo)致品種間差異沒有很好的區(qū)分。隨著芋頭研究越來越受到研究者的重視，大量的SSR，SNP分子標(biāo)記被開發(fā)出來[16-17]，為芋頭的進一步研究提供了很好的工具。本研究收集了來自國內(nèi)多個省份的芋資源，為研究其遺傳關(guān)系及不同類型芋頭對疫病的抗性，擬采用100對SSR分子標(biāo)記對其進行聚類分析，并利用人工接種芋疫霉菌鑒定其抗性。本研究的開展為更好的利用保護，鑒評種質(zhì)資源及其創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所采用的109份芋頭種質(zhì)材料由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所搜集。試驗在廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室完成。時間于2010—2021進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 供試材料于2019年種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗基地。取苗期幼嫩葉片于2m L離心管中。于磨樣機磨碎后用CTAB法提取DNA，用核酸測定儀測定DNA濃度，稀釋至工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)記來源 所用100對引物為文獻[18]公布。采用10份表型差異大的材料進行引物篩選，選擇條帶清晰，重復(fù)性較好，多態(tài)性豐富的SSR標(biāo)記用于進一步遺傳多樣性分析。

1.2.3 SSR擴增體系及檢測

（1）擴增體系為10μL，其中1μL為模板。

（2）PCR擴增程序。94℃預(yù)變性5 m in，95變性30 s，55℃退火30 s，72°C延伸40 s，35個循環(huán)后，72℃延伸7m in，然后置于4℃冰箱保存待檢測。

（3）電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物在濃度為8%的雙垂直非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，120 V穩(wěn)壓1.5 h，電泳結(jié)束后進行銀染顯色，拍照保存分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳圖譜進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，條帶缺失記為“9”，構(gòu)建數(shù)列矩陣，用DataFormater軟件將讀取的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換[19]。用Popgene 32軟件計算觀察等位基因數(shù)(No)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多態(tài)信息指數(shù)(I)。利用生物學(xué)統(tǒng)計軟件DPS中遺傳聚類模塊，基于Jiccard方法進行材料間的遺傳距離計算，得到遺傳距離矩陣，利用MEGA11軟件以類平均法(UPGMA)進行聚類分析，繪制聚類圖[20]。

1.4 疫病抗性鑒定

1.4.1 病原菌的分離 從白云基地芋頭田塊取發(fā)病芋頭葉片于實驗室分離。從病健交接處剪取1×1 cm小塊于70%酒精快速消毒5 s，移入0.1%升汞溶液20 s后移到無菌水中清洗。后用滅菌濾紙將表面水分吸干，置于V8培養(yǎng)基（加入利福平與卡那霉素）上，于28℃恒溫箱培養(yǎng)3天。挑去外圍菌絲轉(zhuǎn)接到新的V8培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天，挑去菌絲提取基因組DNA。以通用引物ITS1、ITS4擴增特異條帶，確定菌株[16]。

1.4.2 接種方法 參考莫俊杰等[15]采用離體葉片接種。取芋頭植株第二新鮮葉片，平鋪托盤中，取培養(yǎng)3天的芋頭疫霉菌塊（沿菌盤邊緣打孔直徑0.5 cm）置于葉片中間位置，躲開主葉脈，每個材料接種3片葉子。保鮮膜封閉托盤保濕。置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。接種5天后測量病斑直徑。

1.4.3 抗性評價方法 參考莫俊杰等[15]利用離體葉片鑒定芋頭對疫病的抗性分級評價標(biāo)準(zhǔn)。即病斑直徑大于40mm為感病，21～40mm為中等抗病，小于20mm為抗病。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選及遺傳多樣性分析

本研究用10份表型差異大的芋頭資源對100對SSR引物進行篩選，獲得了21對多態(tài)性豐富，條帶清晰，穩(wěn)定性好的引物組合，利用這21對引物對109份芋頭種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析。21對SSR引物在109份芋頭資源共擴增71個等位基因，變幅在2～4個，平均等位基因數(shù)3.38。觀測雜合度(Ho)變化范圍為0.0481～0.8900，平均為0.3483；預(yù)期雜合度的變化范圍(He)0.0841～0.6709。平均為0.3794，種群平均Shannon遺傳多樣性指數(shù)為0.6733。遺傳距離在0～1之間，平均遺傳距離為0.6014。Shannon指數(shù)的平均值大于0.5，說明供試芋資源的遺傳多樣性比較豐富（表1、表2）。

表1 引物序列

表2 21對SSR在109份材料中的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 抗病性鑒定

根據(jù)109份芋頭種質(zhì)資源對芋頭疫霉菌的抗性鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大部分芋頭資源表現(xiàn)為感病，只有7份材料表現(xiàn)為中抗（NO.12、NO.19、NO.22、NO.35、NO.43、NO.49、NO.64)，4 份 表 現(xiàn) 為 抗 病 (NO.40、NO.45、NO.59、NO.97)，僅占10%。其中表現(xiàn)中抗的NO.43、NO.19是來自廣東地區(qū)的地方品種，而表現(xiàn)為抗病的NO.40、NO.45、NO.59、NO.97為來自云南八達(dá)的地方品種。從抗病類型來看，魁芋表現(xiàn)抗病的品種比較多，占88%。大部分多子芋表現(xiàn)為感病。缺乏優(yōu)良的疫病抗性資源，也是芋疫病嚴(yán)重影響芋頭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因。

2.3 聚類分析

基于Jaccard方法進行遺傳距離計算，利用UPGMA方法對109份芋頭種質(zhì)材料進行聚類分析，結(jié)果表明，利用21對SSR標(biāo)記可以將109份芋頭資源相互分開，在遺傳距離0.49處可以將供試材料分為3個大類群（圖1）。I為第1類群，II為第2類群，III、IV、V、VI、VII為第3大類群；在遺傳距離在0.30處可將第3類群分為兩個小類群。將類群III與IV、V、VI、VII分開。類群I由來自同一個地方的三個材料(NO.43、NO.19、NO.31)組成，是來自廣東的地方品種。能明顯與其他品種分開，可能是這些地方品種保留了較為豐富的遺傳變異。類群II除NO.54外其他5個材料均來自云南，人工接種芋頭疫霉菌顯示該類群大多數(shù)表現(xiàn)為抗性。類群III以多子芋為主，IV以魁芋為主，V為來自海南的多頭芋，VI以香芋為主，VII以多子芋為主（表3）。從聚類圖可以發(fā)現(xiàn)，除I類群和II類群的地方品種外，其他來自全國各地的的芋頭品種能夠按類別分別聚在一起，比如，淺藍(lán)色大多為多子芋，紫色部分為香芋，橙色部分為多子芋。說明本研究選擇的引物多態(tài)性好，區(qū)分度強，而地理來源對其聚類影響不明顯。這與前人研究結(jié)果相似[7,21]。

表3 109份芋資源信息

續(xù)表3

圖1 109份芋種質(zhì)資源SSR分析聚類圖

3 討論

3.1 芋頭資源遺傳多樣性分析

芋頭資源豐富，全世界芋頭品種有700多種。作為芋頭的起源地之一，中國也有芋頭品種400多種[22]，雖然擁有豐富的種質(zhì)資源，但是由于芋頭大都采用無性繁殖，或者農(nóng)戶自留種，導(dǎo)致種性退化嚴(yán)重，大量資源流失嚴(yán)重[23]。及時有效的對種質(zhì)資源評價和分析，對芋種質(zhì)資源的保護和利用具有重要的意義。以往研究者大多采用 RAPD[5]、AFLP[4]、ISSR[11]標(biāo)記進行遺傳聚類分析。SSR作為穩(wěn)定高效、多態(tài)性高、準(zhǔn)確快速的分子標(biāo)記已經(jīng)被廣泛用于植物多樣性分析、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等多種方面。然而，由于芋資源研究基礎(chǔ)薄弱，目前在芋資源開發(fā)的分子標(biāo)記仍舊較少。有研究者[12,15]以少量SSR標(biāo)記對芋資源進行遺傳多樣性分析，沒有達(dá)到很好的效果。本研究利用新開發(fā)的100對SSR引物，從中篩選重復(fù)性好，多態(tài)性高的引物21對，對109份芋資源進行多樣性分析，將不同類型的芋資源進行了很好的區(qū)分。

本研究所收集芋資源主要為球莖用芋類型。從上述遺傳聚類可以看出，大部分的芋頭資源遺傳距離較近，相似度大。雖然來自不同的地區(qū)，但是種性差異不明顯，遺傳背景較窄。例如：來自浙江溫州多子芋NO.11與來自云南的多子芋NO.103具有相近的遺傳距離，遺傳分類聚在一起。這跟目前物流發(fā)達(dá)，各地資源交流頻繁有關(guān)，但是頻繁交流也限制了地方特色品種的發(fā)展。另外，前人研究野生資源與栽培種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，只有個別野生資源與栽培種聚在一起，本研究中搜集的2個野生芋種(NO.13、NO.103)均與栽培種聚在一起。其原因可能是該野生種資源數(shù)量較少，不具有代表性；另外，可能這些栽培種就是通過該野生種不斷演化而來，這與沈鏑等[6]研究結(jié)果相似。同時我們研究得出大部分資源不以地域差異進行分類，但是少部分地方性材料卻與地理來源緊密相關(guān)。像來自廣東的NO.43、NO.19、NO.31來自海南的NO.44與NO.18具有明顯的地域特點。特別是NO.43、NO.19和NO.31與其它芋種質(zhì)資源親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明這3個品種在長期的遺傳進化過程種保留了自身獨特的遺傳背景，具有很好的利用價值。

3.2 遺傳聚類與品種抗性的關(guān)系

芋疫病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，是芋頭生產(chǎn)上最具破壞性的病害之一[24]。國外研究者對鑒定方法，病原菌的多樣性均有研究[25-28]，在中國對芋疫病研究起步較晚，大都集中在芋疫病的發(fā)生和防治方面[29-30]。資源抗性鑒定相關(guān)報道較少，目前僅有周清平和莫俊杰等在芋頭抗性鑒定方面進行了研究，但是兩者采用了不同的鑒定方法和評價標(biāo)準(zhǔn)，無法對其結(jié)果進行比較。本研究采用了莫俊杰等相同的鑒定方法，均發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)存在抗性品種。由于本研究搜集芋資源范圍更廣，因此還發(fā)現(xiàn)云南八達(dá)也具有抗病品種。同時在本研究還發(fā)現(xiàn)，在供試的109份芋資源中抗性材料雖然不多，僅占10%，但是絕大部分抗性材料集中在第I類（NO.43和 NO.19)和第 II類(NO.59、NO.97、NO.64、NO.40)，占抗性資源的60%，占兩類群資源的75%。說明這兩個來自地方品種的類群具有優(yōu)良的抗性基因，具有很高的利用價值。

3.3 存在問題

芋資源豐富多樣，本研究搜集資源雖然來自全國各地，但是其并不能包含所有芋類型。由于搜集者專業(yè)知識有限，描述性狀標(biāo)準(zhǔn)不一，加之不同地方對同一資源的叫法不同，造成很多資源重復(fù)命名的現(xiàn)象，這也給后續(xù)分子標(biāo)記分析帶來許多困擾。隨著種質(zhì)資源保護越來越受重視，芋資源基礎(chǔ)研究也會不斷得到重視。建議建立國內(nèi)統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，加強基礎(chǔ)研究及種質(zhì)資源的精深鑒評，對芋資源的保護和利用至關(guān)重要。

4 結(jié)論

本研究利用21對SSR引物對109份芋種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，同時利用離體葉片人工接種芋頭疫霉菌的方法對109份芋資源進行了抗病性鑒定。在遺傳距離0.49處可以將供試材料分為3個大類群。人工接種芋疫霉菌鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分抗性材料集中在第I類和第II類群中。這些抗性資源是來自廣東和云南的地方品種，以魁芋類型較多。這對中國芋頭資源的利用和抗性育種具有重要的意義，同時也為我們尋找抗性關(guān)聯(lián)基因奠定了基礎(chǔ)。