崔茂生, 段維旺, 李曉寧，湯 晨，李 凱, 周宇荀, 肖君華

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

隨著人們飲食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而越來越偏向高脂化，動(dòng)脈粥樣硬化[1]、冠心病[2]等心腦血管疾病發(fā)病率逐年升高。肝臟組織作為人體主要的脂質(zhì)代謝器官，參與了脂質(zhì)消化、吸收、合成、分解、運(yùn)輸?shù)壬磉^程。因此，研究人員一直致力于尋找肝臟中與高脂響應(yīng)相關(guān)的潛在基因，這對(duì)預(yù)防和治療高脂血癥具有重要意義。

Tmem176a屬于跨膜蛋白位于人類染色體7q36.1，作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物具有很高的臨床價(jià)值。據(jù)報(bào)道，在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生雜合性丟失，Tmem176a啟動(dòng)子在人類結(jié)直腸癌[3-4]和食管癌[5]中頻繁甲基化，并在這些癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而Tmem176a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6](GBMs)中具有腫瘤促進(jìn)作用，并在細(xì)胞凋亡中起到中心作用，體現(xiàn)出Tmem176a功能具有組織特異性。

本研究使用Tmem176a的過表達(dá)載體plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-EGFP和siRNA-Tmem176a轉(zhuǎn)染小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞，將過表達(dá)、敲低的Tmem176a的Hepa1-6細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整理挖掘，利用生物信息學(xué)算法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因GO注釋和KEGG通路富集分析，為解析Tmem176a調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),測(cè)序樣本信息如表1所示，慢病毒表達(dá)載體Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自上海元象生物科技有限公司；胰酶購(gòu)自上海元象生物科技有限公司；PBS緩沖液購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清購(gòu)自Gbico USA；Lipofectamine TM 3000購(gòu)自InvitrogenUSA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo USA；qPCR試劑盒購(gòu)自近岸蛋白科技有限公司。

表1 RNA-seq樣本信息

1.2 方法

1.2.1Tmem176a慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及siRNA的設(shè)計(jì)

通過NCBI找到小鼠Tmem176a的基因編碼序列(CDS)，通過同源重組方法將Tmem176a的CDS導(dǎo)入Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP載體、純化、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌、測(cè)序。siRNA設(shè)計(jì)原則：(1)從 mRNA 序列的 AUG 起始密碼開始，尋找 AA 二連序列并將其3′端的 19nt 作為潛在的 siRNA 靶點(diǎn)，一般越靠近靶基因 3′端其基因沉默效果可能越出色。(2)序列的GC含量應(yīng)該為30%～60%。(3)非編碼區(qū)有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，會(huì)影響 siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA 從而影響基因沉默的效果，因此要避免在此區(qū)域內(nèi)挑選 siRNA。將挑選的序列進(jìn)行 BLAST 以確保目的序列與其他基因沒有同源性。同源重組引物及siRNA設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 同源重組引物及siRNA設(shè)計(jì)

1.2.2 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

將每種樣本細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板上，待細(xì)胞貼壁且培養(yǎng)至80%的匯合度后進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌Hepa1-6細(xì)胞48 h后將細(xì)胞取出進(jìn)行RNA抽提，建庫(kù)，利用Illumina Hiseq測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估采用軟件FastQC(version 0.10.1)進(jìn)行分析，對(duì)低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)過濾采用軟件Cutadapt(version1.9.1)，參考序列的比對(duì)分析采用軟件Hisat2(version 2.0.1)。轉(zhuǎn)錄組功能注釋采用差異基因表達(dá)分析EdgeR(version 3.4.6)、GO enrichment分析Goseq(version 1.34.1)與 GO(Gene ontologyhttp:∥geneontology.org/)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https:∥www.genome.jp/)，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)具有較高同源性/相似性的序列。

1.2.3 qPCR驗(yàn)證

采用Thermo Fisher Sicentific公司的First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按操作說明進(jìn)行1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，包括4個(gè)過表達(dá)Tmem176a后基因B3gnt6、Rab40b、Klhl30、H2-Q2，包括4個(gè)敲低Tmem176a后基因Prelid3a、Dipk1b、Cdhrl、Aqp1。使用ddH2O將得到的cDNA進(jìn)行10倍稀釋。按照下列體系進(jìn)行qPCR檢測(cè)：10 μL SuperRealPreMix Plus，0.4 μL ROX，2.5 μL cDNA模板，300 nmol/L的上下游引物，補(bǔ)水至20 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火 32 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本做3次重復(fù)。結(jié)果使用相對(duì)定量的方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad Prism軟件，各組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 將Tmem176a的過表達(dá)載體和siRNA-Tmem176a轉(zhuǎn)染進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞中

將Plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-載體和si-RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞，72 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，確定過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約為35%。過表達(dá)和敲低Tmem176a后基因相對(duì)表達(dá)量變化如圖1所示。

(a)過表達(dá)Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。* 表示顯著；** 表示較為顯著；**** 表示極其顯著。

2.2 過表達(dá)、敲低Tmem176a后的Hepa1-6細(xì)胞RNA-seq結(jié)果

2.2.1 過表達(dá)、敲低Tmem176a后差異基因的GO分析

使用OmicShare平臺(tái)GO富集工具進(jìn)行GO分析，使用R繪制結(jié)果如圖2所示，這些DEGs生物學(xué)過程(biological process，BP)主要參與了生物、脂質(zhì)代謝過程、氧化還原過程、定位、對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)代謝過程等。在細(xì)胞組分(cellerular component，CC)方面，DEGs富集于質(zhì)膜成分、細(xì)胞表面等。在分子功能(molecular function，MF)方面，DEGs富集于鈣離子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性、T細(xì)胞受體活性、磷脂結(jié)合等功能。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.2.2 過表達(dá)、敲低Tmem176a后差異基因的KEGG分析

使用OmicShare平臺(tái)GO富集工具進(jìn)行KEGG分析, 使用R 繪制結(jié)果如圖3所示，這些DEGs生物學(xué)過程主要參與了PPAR信號(hào)通路、脂肪的消化和吸收、酪氨酸代謝、膽固醇代謝、鈣信號(hào)通路、蛋白消化和吸收、PI3K-Akt信號(hào)通路、膽汁分泌、AMPK通路等。KEGG富集到的與脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路較多，表明Tmem176a過表達(dá)、敲低后，Hepa1-6細(xì)胞脂質(zhì)代謝通路發(fā)生顯著性變化。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.3 聚類分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)過表達(dá)、敲低Tmem176a后差異表達(dá)基因，將差異表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類分析，篩選依據(jù)為每個(gè)基因在每組樣本間的FPKM值之和≥10、P<0.05，過濾，過表達(dá)、敲低Tmem176a后差異表達(dá)基因數(shù)量分別為322、952，使用R繪制結(jié)果如圖4所示，可以看到過表達(dá)、敲低差異基因可以分為兩類。

(a)表示過表達(dá)Tmem176a后差異基因熱圖；(b)表示敲低Tmem176a后差異基因熱圖。圖下方代表樣本名稱，紅色DEGs代表上調(diào)的差異基因，藍(lán)色的DEGs代表下調(diào)的差異基因,上方分支樹為聚類樣本，左側(cè)分支樹為差異基因聚類，顏色由藍(lán)至紅表示基因表達(dá)量提高。

2.5 qPCR驗(yàn)證

分別從過表達(dá)、敲低的RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)果中隨機(jī)挑選4個(gè)差異基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其中過表達(dá)Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30變化了0.23、0.41、22.05、30.95倍，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b變化了0.26、0.38、37.48、36.84倍。與RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比較，過表達(dá)Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30的Fold Change值分別變?yōu)?5.48(下調(diào))、-5.18(下調(diào))、4.03(上調(diào))、5.22(上調(diào))，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b FoldChange值分別變?yōu)?5.49(下調(diào))、-5.82(下調(diào))、5.48(上調(diào))、5.50(上調(diào))，qPCR結(jié)果如圖5所示。qPCR數(shù)據(jù)與RNA-seq結(jié)果變化趨勢(shì)一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

(a)過表達(dá)Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。

3 討論

試驗(yàn)前期通過WGCNA(加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)、QTL(數(shù)量性狀定位)[7-8]、NGS(二代測(cè)序)[9-10]等手段初步鑒定了大量和血脂代謝相關(guān)的候選基因，本研究前期利用生物信息學(xué)方法分析，從39個(gè)候選基因中篩選出Tmem176a作為脂質(zhì)代謝候選基因。RNA-seq[11-12]數(shù)據(jù)等結(jié)果表明Tmem176a過表達(dá)、敲低后會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)多個(gè)基因的表達(dá)。這些差異表達(dá)基因GO、KEGG、聚類分析結(jié)果均顯示它們與血脂代謝密切相關(guān)，這也恰恰說明Tmem176a可能作為中樞基因來調(diào)控復(fù)雜的血脂代謝網(wǎng)絡(luò)。因此，基于以上分析結(jié)果，初步認(rèn)為Tmem176a基因參與血脂代謝的過程且發(fā)揮重要的作用，但是具體的分子機(jī)制仍需要大量的試驗(yàn)研究。目前，對(duì)Tmem176a基因在小鼠層面的研究較少，大多數(shù)集中在人類且報(bào)道參與了肝癌[13-14]、食道癌、直腸癌、胃癌[15-16]等癌癥進(jìn)展。但是，Tmem176a基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種跨膜蛋白，為什么會(huì)與血脂代謝的陽性基因Srebf2的基因表達(dá)譜類似并且參與到血脂代謝，猜測(cè)在小鼠中Tmem176a可能作為通道蛋白或是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助脂質(zhì)小分子進(jìn)出細(xì)胞，也可能像別的跨膜蛋白如LDL受體一樣能夠與載脂蛋白結(jié)合，或如CD36跨膜蛋白一樣通過識(shí)別脂肪酸從而參與到脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)中。

本研究是針對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞模型檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞基因表達(dá)譜，與小鼠正常細(xì)胞基因表達(dá)譜相比較可能存在差異。在代謝方面，肝癌細(xì)胞也和正常細(xì)胞存在差異。正常細(xì)胞通過新陳代謝的方式，維持正常的生命活動(dòng)；癌細(xì)胞在代謝方面不同于正常的組織細(xì)胞，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的異常旺盛，這樣可能使其代謝方式與正常細(xì)胞相比較而言出現(xiàn)較大差異。

對(duì)細(xì)胞表型和動(dòng)物表型的研究來說，單基因表達(dá)水平的變化在體外、體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)血脂水平并不一定會(huì)產(chǎn)生顯著影響，因此建立與人類血脂代謝相似的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型成為試驗(yàn)研究的重點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外血脂代謝的研究主要采用高脂小鼠[17]、KO小鼠(Knockout Mouse)[18]及轉(zhuǎn)基因小鼠等，但動(dòng)物模型周期長(zhǎng)和花費(fèi)大的特點(diǎn)使得其不適合基因的廣泛驗(yàn)證。

研究表明，Tmem176a過表達(dá)、敲低后都會(huì)影響脂質(zhì)基因表達(dá)水平，Tmem176a通過影響脂肪的消化吸收、膽固醇代謝、甘油酯代謝、脂肪酸合成等代謝途徑參與到脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中。這一研究結(jié)果為脂質(zhì)代謝候選基因的挖掘提供新的發(fā)現(xiàn)，為小鼠脂質(zhì)代謝理論研究奠定基礎(chǔ)。