丁蕾 白慧英 嚴(yán)玉月

（青海省第五人民醫(yī)院皮膚科，西寧 810001）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種皮膚惡性腫瘤，病情發(fā)展快，可發(fā)生多處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康；研究發(fā)現(xiàn)中藥具有抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌的作用［1-2］。紅花多糖是中藥紅花最重要的活性成分之一，已被證實具有抗腫瘤作用；如紅花多糖可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞的增殖［3-4］。紅花多糖還可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。然而紅花多糖對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡的影響及機制尚不清楚。

circ_0014130（circPIP5K1A）一種環(huán)狀RNA，位于chr1：151206672-151212515，研 究報道過表達(dá)hsa_circ_0014130能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［6］。沉默circ_0014130可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7-8］。敲除circPIP5K1A損害了結(jié)腸癌細(xì)胞活力并抑制了細(xì)胞的侵襲和遷移［9］。circNELL2通過使miR-127-5p海綿化而促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展［10］。circ_0026134的下調(diào)通過促進(jìn)miR-127-5p表達(dá)來抑制TRIM25和IGF2BP3介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖和侵襲［11］。而circ_0014130和miR-127-5p對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響尚不清楚。本實驗旨在研究紅花多糖對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡的影響及機制是否與circ_0014130和miR-127-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料SCL-1細(xì)胞株購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海莼試生物技術(shù)有限公司；紅花多糖購自北京伊塔生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒和MTT試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；蛋白提取試劑盒、吉姆薩染色液購自定州百克賽斯生物科技有限公司；Transwell小室購自美國BD公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAt Bioquest公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組SCL-1細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用0.16、0.32、0.64 mg/ml紅花多糖處理，作為紅花多糖低、中、高劑量組；不做任何處理的細(xì)胞作為對照組；將si-NC、si-circ_0014130、miR-NC、miR-127-5p轉(zhuǎn)染至SCL-1細(xì) 胞，記為si-NC組、si-circ_0014130組、miR-NC組、miR-127-5p組；將pcDNA-circ_0014130、anti-miR-127-5p轉(zhuǎn)染至SCL-1細(xì)胞后用0.64 mg/ml紅花多糖處理，記為紅花多糖+pcDNA-circ_0014130組、紅花多糖+anti-miR-127-5p組。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集1.2.1各組細(xì)胞，按試劑盒說明操作，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖活性各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，加入MTT溶液，孵育4 h后加入DMSO溶液，反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細(xì)胞集落形成數(shù)將各組細(xì)胞接種于6孔板，出現(xiàn)肉眼可見克?。s2周）時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS浸洗2次，甲醇固定15 min，再用吉姆薩染色30 min，洗去染液，干燥后在顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的集落。

1.2.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移將細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，制成濃度為5×105個/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl加入Transwell上室，培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS洗2次，甲醇固定后用0.1%結(jié)晶紫染色，然后用顯微鏡觀察計數(shù)細(xì)胞。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，定量后按照30 μg/孔蛋白樣品加樣，進(jìn)行SDSPAGE，然后轉(zhuǎn)膜，再用封閉液封閉，然后加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.7 RT-qPCR檢 測circ_0014130和miR-127-5p的表達(dá)水平提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA后進(jìn)行PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。circ_0014130正向引物序列：5'-AGAAGTTGGAGCACTCTTGGA-3'，反向引 物 序 列：5'-AAAGTCCGAGGGTTCTGG-3'；GAPDH正向引物序列：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，反 向 引物序列：5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'；miR-127-5p正向引物序列：5'-CTCTTCAAGCTCCAAAC?CAAAC-3'，反向引物序列：5'-GTATCCACCAGAAC?CACCAGG-3'；U6正 向引 物 序 列：5'-ATTGGAAC?GATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗使用PCR擴增包含miR-127-5p結(jié)合位點的circ_0014130序列，克隆至熒光素酶表達(dá)載體中，記為WT-circ_0014130，通過定點突變構(gòu)建成MUT-circ_0014130，將其分別與miR-NC和miR-127-5p共轉(zhuǎn)染至SCL-1細(xì)胞，然后按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅花多糖對SCL-1增殖凋亡遷移的影響與對照組相比，紅花多糖低、中、高劑量組SCL-1細(xì)胞凋亡率逐漸升高，細(xì)胞活性逐漸降低，集落形成數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)逐漸減少，Bax表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2表達(dá)水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P<0.05，圖1、表1）。

表1 紅花多糖抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.1 Safflower polysaccharides inhibit SCL-1 colony formation and migration，and induce apoptosis（±s，n=3）

表1 紅花多糖抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.1 Safflower polysaccharides inhibit SCL-1 colony formation and migration，and induce apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with safflower polysaccharide low dose group，2）P<0.05；compared with safflower polysac?charide middle dose group，3）P<0.05.

Groups Control Safflower polysaccharide low dose Safflower polysaccharide middle dose Safflower polysaccharide high dose F P Number of colonies formed 121.67±4.78 101.67±3.301）77.67±3.091）2）52.00±2.161）2）3）227.143<0.01 Apoptosis rate/%6.82±0.35 12.48±0.641）17.16±0.891）2）22.58±1.061）2）3）220.859<0.01 Number of migrating cells 177.33±7.85 142.67±5.911）110.33±4.781）2）78.00±2.941）2）3）170.491<0.01 Bax 0.21±0.02 0.42±0.031）0.67±0.031）2）0.82±0.071）2）3）122.930<0.01 Bcl-2 0.78±0.06 0.55±0.031）0.35±0.021）2）0.15±0.011）2）3）174.940<0.01

圖1 紅花多糖對SCL-1凋亡、細(xì)胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of safflower polysaccharide on SCL-1 apop?tosis，cell viability and protein expressions of Bax and Bcl-2

2.2 紅花多糖對SCL-1中circ_0014130和miR-127-5p表達(dá)的影響與對照組相比，紅花多糖低、中、高劑量組circ_0014130表達(dá)水平逐漸降低，miR-127-5p表達(dá)水平逐漸升高，呈劑量依賴性（P<0.05，表2）。

表2 circ_0014130和miR-127-5p表達(dá)的檢測（±s，n=3）Tab.2 Detection of circ_0014130 and miR-127-5p expres?sions（±s，n=3）

表2 circ_0014130和miR-127-5p表達(dá)的檢測（±s，n=3）Tab.2 Detection of circ_0014130 and miR-127-5p expres?sions（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with safflower polysaccharide low dose group，2）P<0.05；compared with saf?flower polysaccharide middle dose group，3）P<0.05.

Groups Control Safflower polysaccharide low dose Safflower polysaccharide middle dose Safflower polysaccharide high dose F P circ_0014130 1.00±0.00 0.74±0.041）0.46±0.031）2）0.23±0.021）2）3）463.276<0.01 miR-127-5p 1.00±0.00 1.76±0.061）2.34±0.071）2）3.69±0.101）2）3）837.465<0.01

2.3 干擾circ_0014130對SCL-1增殖凋亡遷移的影響與si-NC組相比，si-circ_0014130組可降低circ_0014130表達(dá)水平，提高miR-127-5p表達(dá)水平，降低細(xì)胞活性，減少集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞凋亡率及Bax表達(dá)水平，降低Bcl-2表達(dá)水平（P<0.05，圖2、表3）。

表3 干擾circ_0014130抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.3 Interference with circ_0014130 inhibits SCL-1 colony formation and migration，and induces apoptosis（±s，n=3）

表3 干擾circ_0014130抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.3 Interference with circ_0014130 inhibits SCL-1 colony formation and migration，and induces apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-circ_0014130 t P circ_0014130 1.00±0.00 0.32±0.031）39.260<0.01 miR-127-5p 1.00±0.00 3.10±0.061）60.622<0.01 Number of colo?nies formed 122.33±6.02 65.67±2.051）15.432<0.01 Apoptosis rate/%6.82±0.36 20.88±0.611）34.381<0.01 Number of migrating cells 176.00±8.64 84.33±3.861）16.779<0.01 Bax 0.21±0.02 0.76±0.051）17.690<0.01 Bcl-2 0.79±0.05 0.23±0.021）18.011<0.01

圖2 干擾circ_0014130對SCL-1凋亡細(xì)胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of interference with circ_0014130 on activity of SCL-1 apoptotic cells and expressions of Bax and Bcl-2 proteins

2.4 過表達(dá)miR-127-5p對SCL-1增殖凋亡遷移的影響與miR-NC組相比，miR-127-5p組可降低細(xì)胞活性，減少集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞凋亡率及Bax表達(dá)水平，降低Bcl-2表達(dá)水平（P<0.05，圖3、表4）。

表4 過表達(dá)miR-127-5p抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.4 Overexpression of miR-127-5p inhibits SCL-1 colony formation，migration and induces apoptosis（±s，n=3）

表4 過表達(dá)miR-127-5p抑制SCL-1集落形成、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（±s，n=3）Tab.4 Overexpression of miR-127-5p inhibits SCL-1 colony formation，migration and induces apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-127-5p t P 1.00±0.00 2.90±0.061）54.848<0.01 122.67±5.56 71.33±2.871）14.212<0.01 6.91±0.44 19.64±0.781）24.621<0.01 178.00±9.63 92.67±4.111）14.116<0.01 0.21±0.02 0.72±0.041）19.752<0.01 0.79±0.06 0.30±0.031）12.652<0.01 miR-127-5p Number of colonies formed Apoptosis rate/%Number of migrating cells Bax Bcl-2

圖3 過表達(dá)miR-127-5p對SCL-1凋亡細(xì)胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of overexpression of miR-127-5p on SCL-1 apoptotic cell activity and Bax and Bcl-2 protein expressions

2.5 circ_0014130和miR-127-5p靶向關(guān)系Circu?lar RNA Interactome軟件 預(yù)測 顯示circ_0014130和miR-127-5p有互補序列（圖4A）；雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-circ_0014130與miR-127-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性低于WT-circ_0014130與miR-NC共 轉(zhuǎn) 染 的 細(xì) 胞；而MUT-circ_0014130與miR-127-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）。

圖4 circ_0014130和miR-127-5p互補序列及熒光素酶活性檢測Fig.4 Complementary sequences of circ_0014130 and miR-127-5p and detection of luciferase activity

2.6 過表達(dá)circ_0014130或抑制miR-127-5p對紅花多糖處理的SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響與紅花多糖組相比，紅花多糖+pcDNA-circ_0014130組和紅花多糖+anti-miR-127-5p組可提高細(xì)胞活性，增加集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)，降低細(xì)胞凋亡率，降低Bax表達(dá)水平，提高Bcl-2表達(dá)水平（P<0.05，表5、圖5）。

表5 過表達(dá)circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆轉(zhuǎn)紅花多糖對SCL-1集落形成遷移及凋亡的作用（±s，n=3）Tab.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysaccharides on SCL-1 colony formation，migration and apoptosis（±s，n=3）

表5 過表達(dá)circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆轉(zhuǎn)紅花多糖對SCL-1集落形成遷移及凋亡的作用（±s，n=3）Tab.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysaccharides on SCL-1 colony formation，migration and apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with safflower polysaccharide group，1）P<0.05.

Groups Safflower polysaccharide Safflower polysaccharide+pcDNA-circ_0014130 Safflower polysaccharide+anti-miR-127-5p F P circ_0014130 0.24±0.01 0.90±0.041）-27.726<0.01 miR-127-5p 3.70±0.13 1.24±0.061）1.52±0.071）642.661<0.01 Number of colonies formed 51.33±2.49 114.33±4.641）105.33±2.051）327.225<0.01 Apoptosis rate/%22.68±1.07 8.27±0.451）10.60±0.621）310.951<0.01 Number of migrating cells 78.00±3.74 164.67±4.031）148.67±2.871）497.666<0.01 Bax 0.82±0.07 0.24±0.021）0.30±0.021）160.632<0.01 Bcl-2 0.14±0.01 0.72±0.041）0.63±0.051）208.786<0.01

圖5 過表達(dá)circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆轉(zhuǎn)紅花多糖對SCL-1凋亡、細(xì)胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用Fig.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysac?charide on SCL-1 apoptotic，cell activity and Bax，Bcl-2 protein expressions

3 討論

研究表明多數(shù)中藥多糖具有增強機體免疫力及抗腫瘤等藥理作用［12］。因此，開發(fā)新的中藥多糖對防治皮膚鱗狀細(xì)胞癌具有重要意義。研究報道紅花多糖能顯著抑制HT29結(jié)腸癌細(xì)胞，誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡［13］。紅花多糖通過抑制PI3K/Akt途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡［14］。紅花多糖通過阻斷PI3K/Akt途徑抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和YTMLC-90細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，并抑制體內(nèi)腫瘤的生長［15］。NK細(xì)胞與紅花多糖對體外殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞具有協(xié)同作用［16］。以上結(jié)果表明紅花多糖對多種腫瘤具有抗癌作用。本實驗結(jié)果顯示，紅花多糖低、中、高劑量處理后的SCL-1細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活性降低，集落形成數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)減少，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性；表明紅花多糖呈劑量依賴性抑制SCL-1細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究報道CircPIP5K1A通過miR-376c-3p/ZNF146軸促進(jìn)胃癌的進(jìn)展［17］。circPIP5K1A通過miR-600/HIF-1α調(diào)節(jié)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移［18］。本實驗結(jié)果顯示，抑制circ_0014130表達(dá)后SCL-1細(xì)胞的活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少；表明抑制circ_0014130表達(dá)可抑制SCL-1細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究circ_0014130影響皮膚鱗狀細(xì)胞癌的機制，本實驗通過在線軟件預(yù)測circ_0014130可能靶向結(jié)合的miRNA，結(jié)果顯示，circ_0014130與miR-127-5p有結(jié)合位點，且雙熒光素酶報告實驗證明circ_0014130靶向調(diào)控miR-127-5p。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-127-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［19］。miR-127-5p可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長［20］。本實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-127-5p后，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少；表明過表達(dá)miR-127-5p可抑制SCL-1細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-127-5p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中同樣起抑癌基因作用。

此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)紅花多糖處理后的SCL-1細(xì)胞中circ_0014130表達(dá)水平降低，miR-127-5p表達(dá)水平升高；而過表達(dá)circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆轉(zhuǎn)紅花多糖對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的作用。提示，紅花多糖對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響可能與circ_0014130和miR-127-5p有關(guān)。

綜上所述，紅花多糖可能通過調(diào)控circ_0014130/miR-127-5p抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。