童 鑫,王 菲,帥維維,唐 喆,曹 靜,孫 麗

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院,江蘇 南京 210004)

卵巢功能早衰(簡(jiǎn)稱“卵巢早衰”),是女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一,發(fā)病率在40歲之前為百分之一,30歲之前為千分之一,20歲之前為萬(wàn)分之一[1-3]。該病以原發(fā)性閉經(jīng)或40歲之前繼發(fā)性閉經(jīng)為主要臨床癥狀,通常還會(huì)伴有雌激素水平低下的圍絕經(jīng)期表現(xiàn),嚴(yán)重影響女性生存質(zhì)量。目前,卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制尚未明確,可能與遺傳因素、免疫因素、代謝障礙、感染因素、醫(yī)源性因素、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、個(gè)人行為因素有關(guān)[4]。西醫(yī)多采用激素替代療法(HRT),但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)增加腫瘤和血栓風(fēng)險(xiǎn)。2017年發(fā)布的《早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診療中國(guó)專家共識(shí)》[5]指出,對(duì)于不宜接受激素治療的卵巢早衰患者,可選擇中醫(yī)藥等非激素制劑以緩解低雌激素癥狀,長(zhǎng)期服用不會(huì)增加心血管風(fēng)險(xiǎn)。紫河車可補(bǔ)腎強(qiáng)身,調(diào)補(bǔ)氣血,臨床多用于氣血兩虛所致形體羸瘦、陽(yáng)痿早泄、不孕癥?，F(xiàn)代藥理研究表明,紫河車富含多種甾體激素,可直接刺激卵巢組織,促進(jìn)女性生殖器發(fā)育[6],被中醫(yī)用于卵巢早衰治療安全有效,但具體機(jī)制尚不完全清楚。2007年英國(guó)藥理學(xué)家HOPKINS提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念[7],網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性和藥物間相互作用性等特點(diǎn)與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)相互吻合,符合中醫(yī)藥對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)[8]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選紫河車主要活性成分,運(yùn)用BATMAN-TCM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集紫河車治療卵巢早衰的相關(guān)靶點(diǎn),構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”、靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò),篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路,為進(jìn)一步開(kāi)展紫河車治療卵巢早衰不良反應(yīng)少于HRT的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫河車主要活性化合物篩選 本研究以“ZI HE CHE”為關(guān)鍵詞,通過(guò)BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)在線分析工具,默認(rèn)設(shè)置Score cutoff＞20分、P-value值＜0.05,檢索藥材紫河車的化學(xué)成分和靶點(diǎn)。通過(guò)ADME數(shù)據(jù)庫(kù)(absorption、distribution、metabolism、excretion)篩選,得到紫河車可能活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 與卵巢早衰相關(guān)的靶點(diǎn) 通過(guò)GenCards(The Human Gene Database,https://www.genecards.org/)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man,http://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),以“premature ovarian failure”為關(guān)鍵詞對(duì)卵巢早衰相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索[9],獲取與卵巢早衰相關(guān)的疾病靶點(diǎn),合并去重,統(tǒng)一為基因符號(hào)。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將紫河車的主要活性化合物、靶點(diǎn)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,https://string-db.org/)和Cytoscape 3.9.1[10]軟件構(gòu)建靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)、中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析 為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)基因的功能和紫河車治療卵巢早衰的主要作用通路,將上述篩選得到的藥物與疾病相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/),輸入靶基因名稱列表,并選定物種為“homo sapiens”,設(shè)置參數(shù)P＜0.01,靶點(diǎn)數(shù)(count)≥3,分別進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路注釋分析,將結(jié)果導(dǎo)入R3.6.0軟件,安裝colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程集包,根據(jù)DAVID統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行GO功能、KEGG通路的可視化分析,獲得條圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 紫河車主要活性成分篩選 通過(guò)BATMAN-TCM在線分析工具獲得紫河車的高分活性成分共16個(gè),如17-β-雌二醇、乙醇胺、雌三烯、8-脫氧-14-脫氫-Aconosine、醛固酮等;獲得預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)數(shù)共1 695個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 紫河車中16個(gè)目標(biāo)活性成分和靶點(diǎn)數(shù)

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選 通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得與卵巢早衰相關(guān)的疾病靶點(diǎn)3 125、21個(gè),合并、去重后得到3 146個(gè)。

2.3 藥物和疾病的交集基因 采用Draw Venny Diagram在線程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進(jìn)行去重和篩選,最終將疾病和藥物基因符號(hào)取交集獲得藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶蛋白相互作用關(guān)系,設(shè)置最高置信度(highest confidence)大于0.900生成PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖,將藥物和疾病相映射得到342個(gè)交集靶點(diǎn)在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果包含342個(gè)節(jié)點(diǎn),1 780條連線關(guān)系,靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為10.4。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白,每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系,將數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1中進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖2(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。使用MCODE插件進(jìn)行分析,其中得分較大的EP300、AKT1、TP53、CREBBP、MAPK1、ESR1等靶蛋白均與其他蛋白相互作用較強(qiáng)。見(jiàn)圖3(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。

2.5 “紫河車-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-卵巢早衰”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將紫河車活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、卵巢早衰靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,其中淺藍(lán)色六邊形代表紫河車,綠色圓圈代表共同靶標(biāo),紫色三角代表有效成分,紅色菱形代表卵巢早衰。以degree值調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)大小,degree越高表明與該成分相關(guān)的靶點(diǎn)越多,邊代表靶點(diǎn)與活性成分之間的關(guān)系。見(jiàn)圖4(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。

2.6 GO功能富集分析結(jié)果 根據(jù)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出30個(gè)GO生物過(guò)程。GO功能富集分析顯示,紫河車治療卵巢早衰的作用機(jī)制可能與對(duì)類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(hormone-mediated signaling pathway)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(steroid hormone mediated signaling pathway)等生物過(guò)程有關(guān);與核染色質(zhì)(nuclear chromatin)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體(transcription factor complex)、膜筏(membrane raft)、膜區(qū)(membrane region)等細(xì)胞成分有關(guān);與核激素受體結(jié)合(nuclear hormone receptor binding)、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子活性(transcription coregulator activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等分子功能有關(guān)。見(jiàn)圖5(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果 對(duì)342個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),按照P＜0.05篩選富集通路,得到與卵巢早衰密切相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)通路6個(gè),包括內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、抗葉酸(Antifolate resistance)、鉑耐藥(Platinum drug resistance)、類固醇激素的合成(Steroid hormone biosynthesis)、非同源末端連接(Non-homologous end-junction)。見(jiàn)圖6(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。對(duì)涉及的6條通路圖使用R語(yǔ)言程集包進(jìn)行注釋后再分析顯示,關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集于PI3K-Akt/m TOR信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。代表通路圖見(jiàn)圖7、圖8(掃描標(biāo)題處二維碼查看圖片)。

3 討論

中醫(yī)一般將卵巢早衰歸于“血枯”“早發(fā)絕經(jīng)”“經(jīng)斷前后諸證”范疇。中醫(yī)認(rèn)為,腎藏精主導(dǎo)月經(jīng),腎氣與腎-天癸-沖任-胞宮軸密切相關(guān),對(duì)應(yīng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的下丘腦-垂體-卵巢-子宮性腺軸[11],可見(jiàn)該病致病之本為腎虛及脾虛肝郁失調(diào),可見(jiàn)卵巢早衰與腎、肝、脾3個(gè)臟腑有關(guān)。

紫河車,又稱為胞衣、胎衣等,為健康產(chǎn)婦分娩出的胎盤加工品?！缎榆庒t(yī)案》中用其補(bǔ)任脈,因其含有促性腺激素和雌、孕激素,可促進(jìn)乳腺和女性生殖器官的發(fā)育,調(diào)節(jié)月經(jīng)周期。沖、任二脈能夠直接或間接作用于性腺軸,影響第二性征的發(fā)育,調(diào)節(jié)卵巢及子宮內(nèi)膜的周期性變化[12]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法共篩選出紫河車高分活性成分16個(gè),如雌酮、雌三醇、黃體酮、雄甾酮、雌三烯等,表明紫河車治療卵巢早衰的主要藥效基礎(chǔ)為多種甾體激素。西醫(yī)臨床治療卵巢早衰主要使用雌孕激素序貫療法,通過(guò)周期性補(bǔ)充雌孕激素,經(jīng)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié),降低FSH水平,恢復(fù)卵泡對(duì)促性腺激素的敏感性。長(zhǎng)期使用激素治療,會(huì)增加女性患者子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的發(fā)病率,增加心腦血管疾病和肺栓塞的概率,停藥后易復(fù)發(fā)[13]。本研究PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),度值較大的靶點(diǎn)有 EP300、CREBBP、ESR1、TP53、AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3CA、PIK3R1等,這些靶點(diǎn)可能是紫河車治療卵巢早衰的主要作用靶點(diǎn)。如MAPK1就是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員,其在包括氧化應(yīng)激、DNA損傷、癌癥發(fā)展和病毒感染在內(nèi)的環(huán)境應(yīng)激下被激活[14]。MAPK通路大致可分為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和應(yīng)激激活蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(SAPK/JNK)三大類[15]。GO功能富集分析可見(jiàn)對(duì)類固醇激素反應(yīng)、對(duì)肽激素的反應(yīng)、腺體發(fā)育、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程在紫河車治療卵巢早衰中起到了關(guān)鍵作用。通過(guò)KEGG富集分析顯示,紫河車主要活性成分相關(guān)靶點(diǎn)涉及內(nèi)分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、抗葉酸、鉑耐藥、類固醇激素的合成、非同源末端連接等,關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集于PI3K-Akt/m TOR信號(hào)通路、c AMP信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。

卵巢早衰源于卵泡閉鎖,很多分子都會(huì)影響卵泡的發(fā)育,細(xì)胞外的分子都需依靠信號(hào)通路的傳導(dǎo)才能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng),所以對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控,可以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。卵巢早衰的發(fā)生與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密。卵巢微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟非常重要,卵母細(xì)胞分泌多種因子促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖,顆粒細(xì)胞產(chǎn)生多種物質(zhì)支持卵母細(xì)胞的成熟[16]。二者共同參與調(diào)節(jié)卵泡成熟及排卵的過(guò)程,涉及的信號(hào)通路如PI3K-Akt、m TOR、MAPK 等[17]。PI3K-Akt/m TOR信號(hào)通路也是細(xì)胞增殖和凋亡的主要傳導(dǎo)通路之一[18]。卵母細(xì)胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)的過(guò)度激活可使原始卵泡過(guò)早發(fā)育及卵泡過(guò)快凋亡,進(jìn)而發(fā)展成為卵巢早衰。相關(guān)文獻(xiàn)指出,PI3K和Akt信號(hào)通路參與卵巢早衰的發(fā)生,終止PI3K的信號(hào)可能導(dǎo)致原始卵泡過(guò)早發(fā)育,并過(guò)快凋亡,從而導(dǎo)致卵巢早衰[19]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是PI3K-AKT軸下游的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的增殖和抑制,對(duì)卵泡的調(diào)節(jié)起重要作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn),m TOR信號(hào)通路異常對(duì)小鼠的早期胚胎發(fā)育甚至出生后的生長(zhǎng)都有影響[21]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度預(yù)測(cè)紫河車治療卵巢早衰的可能藥效成分、主要作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路,為進(jìn)一步開(kāi)展紫河車治療卵巢早衰不良反應(yīng)少于HRT的機(jī)制研究和藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性,后期須對(duì)主要活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路進(jìn)行驗(yàn)證。