于 凱，卜 凡，李 鵬，蘇 秦，夏 蕾，薛金曄，郝 雷

(1.內蒙古醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 兒科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古醫(yī)科大學 內蒙古臨床醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010110；4.內蒙古醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，內蒙古 呼和浩特 010110)

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球癲癇患者超過5 000萬，而癲癇患者中有超過八成分布在發(fā)展中國家，其中我國癲癇患者超過600萬，每年還有40萬左右的新發(fā)癲癇患者，我國癲癇患病率為4‰～7‰，年發(fā)病率在3左右[1]。目前，抗癲癇藥物治療為目前臨床最主要的治療方案，對于癲癇短期臨床發(fā)作，60%～70%的患者可以實現(xiàn)無癲癇癥狀發(fā)作[2]，但對于癲癇的長期治療尚無滿意治療方案[3]。

藥物額爾敦-烏日勒，也稱額爾敦-烏日勒，是蒙藥中治療和預防神經(jīng)和精神系統(tǒng)疾病的常用藥物，具有神經(jīng)保護及神經(jīng)再生作用[4-5]。據(jù)研究表明此藥不僅能抑制癲癇的發(fā)生和發(fā)作程度，還能減輕癲癇發(fā)作后的認知及情緒方面的并發(fā)癥[6]。但迄今為止，額爾敦-烏日勒治療癲癇的作用靶點及潛在作用機制尚不明確。本研究將基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討額爾敦-烏日勒治療癲癇的作用靶點及潛在作用機制，現(xiàn)將研究情況報道如下。

1 研究方法

1.1 額爾敦-烏日勒活性成分的靶點分析

利用藥物口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，通過篩選中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP數(shù)據(jù)庫)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch)和HERB數(shù)據(jù)庫(http：//herb.ac.cn/)預測出額爾敦-烏日勒的主要有效成分靶點，在UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)中輸入有效成分對應的作用靶點，篩選條件為Human，將全部靶點統(tǒng)一為標準格式。

1.2 乳腺癌疾病潛在作用的靶點分析

檢索TTD(http：//db.idrblab.org/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)數(shù)據(jù)庫、Phenopedia數(shù)據(jù)庫(https：//phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)，以 “epilepsy”“breast carcinoma”“Seizures”為關鍵詞，檢索與癲癇相關的靶基因，獲得疾病的相關作用靶點。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Venny圖對藥物的作用靶點與疾病相關的作用靶點進行交集，所得出的交集靶點為額爾敦-烏日勒治療癲癇的關鍵靶點。

1.4 藥物成分-疾病-關鍵靶點網(wǎng)絡的建立

應用Cytoscape 3.7.2軟件繪制并建立“藥物成分-疾病-關鍵靶點”關系網(wǎng)絡，網(wǎng)絡外圍節(jié)點代表疾病與藥物成分的關鍵靶點，整個網(wǎng)絡將展示藥物成分-疾病-關鍵靶點之間的聯(lián)系，通過構建這一網(wǎng)絡，探究額爾敦-烏日勒抗癲癇的作用機制。

1.5 關鍵靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建

利用STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺(https：//string-db.org/)，預測關鍵靶點的蛋白相互作用關系。將藥物與疾病交集作用靶點的文件導入到STRING數(shù)據(jù)庫，將研究物種設置為人類(Homo sapiens)，其他參數(shù)保持默認設置。利用Multiple proteins工具，構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡模型，獲得關鍵靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。

1.6 GO富集分析和KEGG通路分析

利用AmiGO2平臺(http：//amigo.geneontology.org/amigo)和bioinformatics平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/login/)，對獲得的基因進行GO富集分析和KEGG通路分析，以P<0.05作為篩選條件，分別繪制出通路圖和dotplot點圖。

1.7 關鍵作用位點與額爾敦-烏日勒主要成分的分子對接

選取額爾敦-烏日勒內關鍵成分與潛在的作用位點，利用AutodockTools1.5.6進行分子對接，驗證所預測關鍵靶點與藥物主要活性成分之間的結合效果。其具體操作方法為：①在PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索獲得額爾敦-烏日勒主要活性成分的SDF結構文件，利用Chem3D軟件及AutoDockTools1.5.6軟件將SDF文件轉化為PDBQT文件；②在Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(http：//www1.rcsb.org/)中檢索出并獲得關鍵蛋白的PDB格式，利用PYMOL 2.3.4軟件去除獲得蛋白中的水分子及小分子配體。利用AutoDockTools1.5.6軟件對獲得蛋白進行加氫、平衡電荷等操作，將其保存為PDBQT文件；③在AutoDockTools1.5.6中利用Grid Box命令打開Grid Options工具對每個受體蛋白進行處理，通過設置配體盒子的中心位點和大小，將受體蛋白轉化為PDBQT文件；④利用AutoDock Vina對受體蛋白與配體小分子分別進行分子對接，結合能(affinity)打分及對接參數(shù)。結合能數(shù)值越低，代表受體-配體復合物具有越好的結合效果；⑤選取與配體分子結合效果好的靶點，輸出分子對接模擬圖，采用PyMOL 2.3.4軟件將分子對接模擬圖及可能的結合位點結果可視化。

2 結果

2.1 額爾敦-烏日勒抗乳腺癌的潛在作用靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索，獲得其中收錄的額爾敦-烏日勒中主要作用靶點共246個。檢索OMIM數(shù)據(jù)庫、Phenopedia數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫，共檢索到癲癇潛在作用靶點1 250個。整合獲得數(shù)據(jù)，去除重復項，共有乳腺癌潛在作用靶點1 076個。利用Venny圖對藥物的作用靶點與疾病相關靶點進行交集，共獲得關鍵靶點47個，見圖1。共獲得關鍵靶點AR、NOS2、GSK3B、GRIA2、GABRA1、PTGS2、EGFR、AKT1、TNF、HIBCH、NR1I2、PRKCB、AKR1B1、MAOA、ADORA1、GLO1、APP、MMP9、CYP1B1、ABCG2、ABCC1、ACHE、ABCB1、TERT、F2、DRD4、GRM1、MTNR1B、SLC6A3、EPHX1、P2RX7、TNFRSF1B、SLC6A4、SCN5A、CHRNA7、CHRM3、CHRM1、CYP1A1、CASP8、HTR2A、PPARG、ALDH2、CASP1、MMP8、ITGA4、ITGB3、BRAF，共47個。

圖1 額爾敦-烏日勒中主要作用靶點及關鍵靶點

2.2 藥物成分-疾病-關鍵靶點網(wǎng)絡的建立與分析

將額爾敦-烏日勒的主要作用靶點和癲癇疾病相關疾病靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建藥物成分-疾病-關鍵靶點網(wǎng)絡(圖2)。左側圖的中心位置為癲癇疾病，右側圖的中心位置為額爾敦-烏日勒成分，周圍節(jié)點為兩者共同相關基因。圖中共有藥物和疾病共同靶點47個，共1 275個節(jié)點，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關系——即“邊”，共有1 342條“邊”。

圖2 藥物成分-疾病-關鍵靶點網(wǎng)絡

2.3 蛋白質-蛋白質互相作用網(wǎng)絡的構建

將47個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡模型，如圖3所示。在PPI網(wǎng)絡中，“邊”代表作用靶點之間的關聯(lián)，其粗細用combine score表示，“邊”越粗，combine score值越大，代表其結合度越大；節(jié)點代表作用靶點。由導出結果可知，該網(wǎng)絡模型共有47個節(jié)點、207條邊，平均節(jié)點度(Degree)為8.81，Degree值越大即表示該靶點處于網(wǎng)絡的核心地位，經(jīng)可視化處理后得到圖3，Degree值越大具有更大的圖像和更亮的顏色，如共同靶點中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、淀粉樣前體蛋白(APP)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、腫瘤壞死因子(TNF)及表皮生長因子受體(EGFR)這些蛋白在藥物治療疾病的調控過程中起關鍵作用。

圖3 蛋白質-蛋白質互相作用網(wǎng)絡

2.4 GO富集分析

在GO富集分析結果中，選取P值排名前5的生物功能(Biological processes，BP)，可得額爾敦-烏日勒主要影響包括鞘脂易位作用、多巴胺能對突觸傳遞的負調節(jié)、受體生物合成過程、白細胞介素1α分泌的正調控和異種運輸。其細胞成分(Cellular component，CC)膠質細胞投射、轉移酶復合物-轉移含磷基團、軸突、整合素復合物和主軸突。其分子功能(Molecular function，MF)排名前5的分別是外源性跨膜轉運ATP酶活性、G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體活性、多巴胺、鈉共轉運蛋白活性、乙酰膽堿結合和鞘脂轉運蛋白活性，見圖4。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，47個關鍵靶點顯著富集在68條通路上(P<0.05)，其靶點主要作用于包括色氨酸代謝通路、抗葉酸通路、組氨酸代謝通路、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用和鈣信號通路等通路中，提示額爾敦-烏日勒通過多種作用、多條通路發(fā)揮治療癲癇的作用，見圖5。將KEGG通路富集情況經(jīng)可視化處理，通路中富集的靶點數(shù)目越多，所對應圓圈越大；顏色越深，則藥物對應靶點越可能為乳腺癌治療靶點，如圖6所示；其中有關5-羥色胺能突觸通路影響最為明顯。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 KEGG通路富集情況可視化處理

選取藥物成分-疾病-關鍵靶點網(wǎng)絡高于平均值的靶點，選取額爾敦-烏日勒中主要成分異鼠李素(isorhamnetin)、木犀草素(luteolin)、異牧荊素(isovitexin)、?；悄懰徕c(Deoxycholic Acid)和3-甲基環(huán)十五烷酮(3-Methyl desoxycholate)與靶點進行分子對接，結合能<-7.0 kcal·mol-1表示具有較好的結合效果，對接的效果與結合能負值大小呈正相關。分子對接情況，如表1所示。結果顯示，化合物與靶蛋白的最低結合能都<0，說明配體與受體可以自發(fā)結合，其中aldh2-木犀草素、Cyp1a1-木犀草素、Casp8-3-甲基環(huán)十五烷酮結合能較低，其分子對接模式見表1和圖7-圖10。

圖7 Cyp1a1-木犀草素及結合位點

圖8 aldh2-木犀草素及結合位點

圖9 Casp8-3-甲基環(huán)十五烷酮及結合位點

圖10 MAOa-甲基環(huán)十五烷酮及結合位點

表1 關鍵靶點與其相關化合物的結合能

3 討論

現(xiàn)代研究表明，額爾敦-烏日勒具有治療白脈病的功效，白脈病指的是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，一般癥狀是渾身抽搐、口眼歪斜等，這與臨床醫(yī)學中的癲癇相對應[7]。在已有研究中，額爾敦-烏日勒被證實具有減輕腦電圖與肌電圖在彌漫性不規(guī)則中、高波幅混合慢波上，夾雜大量雜亂多灶性棘波、尖波等癲癇特異性腦電圖的效果[8]，但其具體機制尚未明確，因此探索額爾敦-烏日勒的主要成分及其在治療癲癇方面的主要作用位點，有助于進一步探討癲癇的發(fā)生機制并為開發(fā)靶向治療藥物提供理論依據(jù)。

額爾敦-烏日勒中的黃酮類化合物具有調節(jié)炎癥和細胞生存相關的microRNA表達的特性，可緩解癲癇發(fā)作時口眼歪斜和四肢抽搐等癥狀[9]，額爾敦-烏日勒中木犀草素可通過降低表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)的 mRNA 表達，從而抑制 EGF 介導氧化磷酸化、ERK 和 MARK-PI3K-Akt信號通路激活[10-11]，可增強腦內神經(jīng)膠質細胞穩(wěn)定性，從而抵抗癲癇發(fā)生[12]。鄭新元等[13]研究發(fā)現(xiàn)，從藥物抗癲癇活性部位中提取出的總黃酮含量越高，其抗癲癇的作用也越強。因此在一定的劑量下，額爾敦-烏日勒能顯著抑制大鼠癲癇的發(fā)生[14]。黃酮類化合物是導致海馬環(huán)磷腺苷效應元件蛋白(CREB)磷酸化，進而導致細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)升高的一種多酚類化合物。類黃酮家族幾個成員也可通過CREB-BDNF通路的相互作用表現(xiàn)出對癲癇發(fā)作的抑制[15]。在國外學者的研究中，黃酮類化合物可通過增強海馬內星形膠質細胞中BDNF的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可提高神經(jīng)元對于癲癇發(fā)生時局部異常放電刺激的抵抗能力，從而降低癲癇的發(fā)作強度和發(fā)作時間[16-17]。

本研究中，額爾敦-烏日勒中黃酮類化合物對于caspase-8、caspase-9、MAOA等位點具有較高的親和性。有證據(jù)表明，癲癇發(fā)作停止是由于誘導細胞程序性死亡的結果，有關的癲癇凋亡標記物caspase-1、caspase-2、caspase-8、caspase-9與全身性癲癇的發(fā)作呈正相關[18]。其中的caspase-8比caspase-9能更有效阻斷癲癇誘導細胞死亡[19]。癲癇的發(fā)作多由于腦中5-HT不足引起，單胺氧化酶(MAOA)可以降解5-HT這種抑制性神經(jīng)遞質，5-HT濃度的降低可能導致神經(jīng)調質系統(tǒng)的失衡[20]，導致腦內神經(jīng)突觸異常，從而增加癲癇發(fā)生的可能性。在另一些研究中，部分學者發(fā)現(xiàn)針對抑制MAOA的治療已被證實有強有力的抗驚厥能力，對于癲癇的治療具有良好的效果[19]。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學的手段對額爾敦-烏日勒的主要活性成分及藥理作用，以及與癲癇作用通路的關系進行了分析，闡述了額爾敦-烏日勒通過多靶點、多通路的復雜作用機制調節(jié)癲癇相關信號表達從而達到抗癲癇的作用，為進行更深入的相關實驗研究奠定了基礎，同時也為進一步研究一種潛在的、安全有效的癲癇輔助用藥提供了新思路。