瞿昊宇，謝夢洲，陳光宇*，何 群

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208；5.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410208)

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，一般于春、秋兩季采挖未抽花莖植株的根，除去須根和泥沙曬干制成[1]。防風(fēng)主產(chǎn)于中國黑龍江、吉寧、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、寧夏、甘肅、陜西、山西、山東等省區(qū)[2]，生長于草原、丘陵、多礫石山坡，根供藥用，是中國東北地區(qū)著名藥材之一[3]，有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效，用于感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)等癥，其味辛、甘，微溫[4]，收載于2020版《中國藥典》一部156頁“防風(fēng)藥材及飲片”項下，但只記載了其性狀、鑒別、檢查、含量測定等，未收載指紋圖譜檢測。防風(fēng)主要有效成分為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，具有較好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫等活性作用[5]。由于受天氣、土壤、環(huán)境、產(chǎn)地、采收時間、采收方法的影響，防風(fēng)藥材的成分存在差異，僅從已有的檢測項目無法控制藥材質(zhì)量[6，7]，研究其單體成分并不能洞悉防風(fēng)藥材功效的全貌，從而影響防風(fēng)藥材及飲片的質(zhì)量控制及質(zhì)量評價[8-10]。為確保防風(fēng)藥材及飲片的質(zhì)量與療效，避免摻入長蛾子的防風(fēng)，指導(dǎo)防風(fēng)藥材產(chǎn)地的加工炮制，本研究考察與評價了從防風(fēng)藥材-飲片的量值傳遞率、指紋特征變化，并建立了防風(fēng)藥材及飲片指紋圖譜的分析方法，通過方法學(xué)論證，考察了防風(fēng)炮制前后的差異，為指導(dǎo)防風(fēng)藥材產(chǎn)地加工炮制，確保防風(fēng)飲片的質(zhì)量與療效提供了依據(jù)。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，包括G1316A四元梯度泵、G1313A標準型自動進樣器、G1316A恒溫箱、G1314A紫外檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站)；中文液晶臺式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TCS-100型電子臺秤(上海乾峰電子儀器有限公司)；PW135型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；QY-1中藥切片機(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；HWS-80B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市意博高科實驗儀器廠)；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；LC-E096P灶頭(電陶爐，廣東順德忠臣電器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

23批防風(fēng)藥材經(jīng)本校藥植鑒定教研室王智副教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根；防風(fēng)飲片(由本實驗室自制)；升麻素苷對照品(批號：111522-201712)，購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標準物質(zhì))，供含量測定用(升麻素苷含量96.2%)；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號：111523-201610)，購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標準物質(zhì))，供含量測定用(5-O-甲基維斯阿米醇苷含量96.1%)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；洗脫方式：線性梯度，0～70 min(20%甲醇～90%甲醇)，檢測波長為254 nm，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：10μL，柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按升麻素苷峰計算，應(yīng)不低于2 000。

2.2 基本分析方法

按照高效液相色譜法(通則0512)的相關(guān)要求進行測定，具體操作如下。

(1)升麻素苷對照品溶液的制備：取升麻素苷對照品約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷濃溶液1；精密移取1mL升麻素苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷濃溶液2；精密移取6 mL升麻素苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中。

(2)5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液的制備：取5-O-甲基維斯阿米醇苷約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷61.2 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，即得。

(3)供試品溶液的制備：取過五號篩(80目)的防風(fēng)藥材細粉，約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取4 mL離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，即得。

(4)陰性對照供試品溶液的制備：取缺防風(fēng)藥材和防飲片樣品的流動相溶劑，按“2.2”項下(3)的方法同法制備，即得陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜峰，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.784%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，測定其HPLC圖譜，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.869%，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進樣，測定其HPLC圖譜，各共有峰相對保留時間和峰面積的比值基本一致，RSD=2.131%，表明供試液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜色譜峰的標定

取升麻素苷對照品約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷1.08 mg的升麻素苷濃溶液1；精密移取1 mL升麻素苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷0.108 mg的升麻素苷濃溶液2；精密移取6 mL升麻素苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含升麻素苷64.8 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中；取5-O-甲基維斯阿米醇苷約0.010 0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷1.02 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1；精密移取1 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液1于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷0.102 mg的5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2；精密移取6 mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含5-O-甲基維斯阿米醇苷61.2 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶中，進行高效液相色譜分析[6]。通過比較對照品圖譜與樣品圖譜，對樣品圖譜中的色譜峰進行標定，樣品圖中保留時間為11.8 min處的色譜峰為升麻素苷對照品的色譜峰，保留時間為19.68 min處的色譜峰為5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的色譜峰。見圖1至圖7。

圖1 陰性對照品指紋圖譜(甲醇空白)

圖2 升麻素苷對照品指紋圖譜

圖3 5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品指紋圖譜

圖4 防風(fēng)藥材供試品指紋圖譜

圖6 23批防風(fēng)藥材供試品指紋圖譜

圖7 23批防風(fēng)飲片供試品指紋圖譜

2.5 防風(fēng)藥材和飲片的HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)(相似度計算)

采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版》，對23批防風(fēng)原藥材和防風(fēng)飲片的指紋圖譜進行分析，設(shè)定時間窗寬度、多點校正、譜峰匹配，生成的對照圖譜見圖3、圖4。由圖3、圖4可知，每批防風(fēng)藥材和防飲片皆含有15個共有色譜峰，其中3號峰面積較大且較穩(wěn)定，因此選擇3號峰作為參照峰(保留時間為11.8 min是升麻素苷；5號峰保留時間為19.68 min是5-O-甲基維斯阿米醇苷)。對23批防風(fēng)藥材和防風(fēng)飲片各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度進行計算，結(jié)果見表1。

表1 防風(fēng)藥材和飲片的指紋圖譜相似度分析結(jié)果

2.6 防風(fēng)藥材和飲片指紋圖譜特征分析與比較

對23批防風(fēng)原藥材和防風(fēng)飲片指紋圖譜相似度進行配對t檢驗，得配對樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.937 4，其均值差異檢驗t=0.684 1，df=22，P=0.501 1，結(jié)果表明防風(fēng)原藥材和防風(fēng)飲片指紋圖譜大體一致，防風(fēng)炮制前后其化學(xué)成分變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

本研究建立了可同時分析防風(fēng)藥材及飲片的指紋圖譜分析方法，發(fā)現(xiàn)防風(fēng)藥材與防風(fēng)飲片指紋圖譜相似度差異不大，說明指紋圖譜中成分大多屬于熱穩(wěn)定性成分，可同時作為防風(fēng)藥材與防風(fēng)飲片的質(zhì)量標準項目。

通過對防風(fēng)藥材及飲片指紋圖譜供試品制備方法進行研究，發(fā)現(xiàn)超聲法提取供試品相似度均值為0.739左右，與回流法提取供試品差異較大，故供試品制備參考《中國藥典》2020版“防風(fēng)含量測定”項下供試品制備方法，采用回流法提取供試品。

本研究成果已經(jīng)通過了防風(fēng)藥材150 kg炮制飲片放大試驗的驗證，防風(fēng)藥材與放大試驗炮制飲片相似度均大于0.9，說明本研究成果可作為防風(fēng)飲片工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制標準之一。