劉傳夢(mèng)，楊丹荔，馮秋瑜，2 *

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤醫(yī)藥與醫(yī)養(yǎng)結(jié)合人才小高地，廣西 南寧 530020)

螞蝗七ChiritafimbrisepalaHand.-Mazz.又名石螃蟹、石蜈蚣、紅螞蝗七、巖白菜、水白菜等，為苦苣苔科唇柱苣苔屬Chirita的植物，以根莖入藥[1]。螞蝗七生于林中石上，山林濕地，為廣西瑤族民間習(xí)用草藥。其性涼，味微苦，具有清熱利濕、行滯消積、止血活血、解毒消腫的功效，多用于治療胃腸道疾病以及跌打外傷[2]，瑤族民間常用于治療消化不良及小兒疳積等。近年來，關(guān)于螞蝗七成分研究發(fā)現(xiàn)，它的主要化學(xué)成分為黃酮類。螞蟥七總黃酮是螞蟥七根莖中具有藥理活性的主要成分之一，前期研究證實(shí)其具有廣泛的抗菌、抗炎的藥理作用[3-4]。目前已確定的化合物為mahuangchiside(Ⅰ)，hispidulin(Ⅱ)，kaempferol(Ⅲ)和甾醇苷daucosteral(Ⅳ)[5]，其中II和III首次從Gesneriaceae家族中分離得到，并首次從Chirita屬中分離出Ⅳ[6]。對(duì)螞蟥七藥理作用研究主要集中在抗菌、抗炎等方面。在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)螞蝗七能抑制腸道收縮，對(duì)腹瀉的患者具有很好的療效，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬以小鼠腸平滑肌為研究對(duì)象，研究螞蝗七水提液對(duì)離體腸平滑肌的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

KM種小鼠，SPF級(jí)，雌雄兼用，體質(zhì)量(20±2)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證編號(hào)：SCXK(湘)2016-0002)。

1.2 儀器

BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；HW-400E型恒溫平滑機(jī)槽(成都泰盟軟件有限公司)；PT-100型生物張力傳感器(成都泰盟軟件有限公司)。

1.3 藥品與試劑

螞蝗七采集于廣西來賓市金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物螞蟥七ChiritafimbrisepalaHand.-Mazz的根；乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160523)；阿托品(Atropine，Atr，民生藥業(yè)集團(tuán)紹興醫(yī)藥有限公司，批號(hào)0601002)；Tyrode's溶液所用試劑均為分析純，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Tyrode’s溶液配制[7]

取NaH2PO4·2H2O 0.065 g、CaCl20.2 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.26 g、NaHCO31.0 g、葡萄糖1.0 g，CaCl2溶液須在其他基礎(chǔ)溶液混合并加蒸餾水稀釋之后，方可攪拌。同時(shí)，逐滴加入，否則將生成鈣鹽沉淀，葡萄糖在臨用前即時(shí)加入，加入葡萄糖的溶液不能久置。

2.2 樣品的制備

取螞蝗七原藥材200 g，適當(dāng)粉碎，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱煮沸，小火保持微沸，煎煮1.5 h取出，用8層紗布過濾。藥渣內(nèi)加入8倍量水，煎煮1 h，取出用8層紗布過濾。藥渣內(nèi)再加入8倍量水，再煎煮1 h，取出用8層紗布過濾，合并煎煮液，用8層紗布過濾，水浴濃縮至200 mL，得到含生藥1 g·mL-1的螞蝗七水煎液。

2.3 實(shí)驗(yàn)裝置

將生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、恒溫平滑機(jī)槽、張力傳感器等按圖1安裝。設(shè)置恒溫平滑機(jī)槽的溫度為37 ℃，調(diào)節(jié)空氣流速，速度為每秒1～2個(gè)氣泡。浴槽內(nèi)管裝入新鮮配置的15 mL Tyrode營養(yǎng)液。將十二指腸掛在浴槽中，一端用線結(jié)一角，固定于張力傳感器上與生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)相連，另一端固定在L型通氣鉤上，記錄十二指腸收縮時(shí)張力的變化。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置

2.4 離體小腸平滑肌的制備

取禁食12 h后的小鼠，脫頸椎致死，立即剖開腹腔，找出胃幽門與十二指腸交界處，以此為起點(diǎn)，取十二指腸近端6～8 cm腸管置于裝有Tyrode溶液的平皿中[8-12]。

2.5 螞蝗七水煎液對(duì)正常小鼠離體腸平滑肌的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min，然后加入0.1 mL的蒸餾水(空白對(duì)照組)或加入0.1 mL不同濃度的受試藥液(其終濃度分別為12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，記錄加入蒸餾水或受試藥液后的曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

2.6 螞蝗七水煎液對(duì)Ach致小鼠離體腸平滑肌興奮作用的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min(計(jì)算1，5，10 min時(shí)間點(diǎn)張力，取平均值作為正常值)，然后加入1.5×10-5g·mL-1Ach 2滴，1 min 后加入0.1 mL蒸餾水(對(duì)照組)或不同濃度的受試藥液(其終濃度分別為 12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，并記錄曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

2.7 螞蝗七水煎液對(duì)Atr致小鼠離體腸平滑肌抑制作用的影響

取“2.4”方法制備的腸段，放入恒溫平滑肌槽穩(wěn)定約30 min后，記錄正常曲線5 min(計(jì)算1，5，10 min時(shí)間點(diǎn)張力，取平均值作為正常值)，然后加入0.5 mg·mL-1Atr 0.1 mL，1 min后加入0.1 mL蒸餾水(對(duì)照組)或同體積不濃度的受試藥液(其終濃度分別為12.5，25，50，75，100 mg生藥·mL-1)，并記錄曲線10 min，觀察小鼠離體腸段的收縮張力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 螞蝗七水煎液對(duì)正常小鼠離體腸平滑肌收縮作用的影響

結(jié)果表明，螞蝗七水煎液能使腸肌張力降低，收縮幅度變小，給藥前后比較平均張力、頻率有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。給藥前后比較，螞蝗七水煎液在50、75、100 mg生藥·mL-1劑量?jī)?nèi)，具有顯著差異。說明螞蝗七水煎液對(duì)正常小鼠離體腸平滑肌收縮作用有明顯抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、圖2、圖3。

表1 各劑量螞蟥七對(duì)小鼠正常離體腸平滑肌頻率和平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-e表示12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

4.2 螞蝗七水煎液對(duì)Ach致小鼠離體腸平滑肌收縮作用的影響

結(jié)果顯示，Ach造成離體腸平滑肌興奮模型，表現(xiàn)為基線上升、張力明顯提高。給藥前與給藥后比較平均張力，在50、75、100 生藥mg·mL-1劑量時(shí)，說明螞蝗七水煎液具有對(duì)抗Ach興奮小鼠離體平滑肌的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、圖4、圖5。

表2 各劑量螞蟥七Ach致離體腸平滑肌興奮平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-f表示0、12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

4.3 螞蝗七水煎液對(duì)Atr致小鼠離體腸平滑肌抑制作用的影響

結(jié)果顯示，Atr造成離體腸平滑肌抑制模型，表現(xiàn)為基線下降、張力明顯降低。給藥前后比較平均張力，在50、75、100生藥mg·mL-1劑量，具有顯著性差異，說明高劑量的螞蝗七水煎液與Atr可協(xié)同作用于小鼠離體平滑肌，使離體平滑肌抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、圖6、圖7。

表3 各劑量螞蟥七Ach致離體腸平滑肌興奮平均張力的影響

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01，ns沒有差異。

注：a-f表示0、12.5、25、50、75、100 生藥mg·mL-1。

5 討論

本研究表明，在生藥50～100 mg·mL-1劑量的螞蝗七水煎液對(duì)小鼠正常離體腸的運(yùn)動(dòng)具有不同程度的抑制作用，呈劑量依賴性。Ach為M受體激動(dòng)劑，M受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在結(jié)合Ach后生成第二信使IP3，激活肌漿網(wǎng)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，誘導(dǎo)腸肌收縮[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)螞蟥七能明顯拮抗Ach對(duì)小鼠離體腸平滑肌的興奮作用。Atr是M受體拮抗劑，能可逆性阻斷節(jié)后膽堿能神經(jīng)支配的效應(yīng)器上的M受體，Atr通過與Ach競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合M受體，能抑制腸道收縮，解除平滑肌痙攣[14]。我們研究發(fā)現(xiàn)螞蝗七對(duì)Atr的舒張起到協(xié)同作用。由此可以推測(cè)瑤藥螞蝗七水煎液可能通過阻斷M受體，從而減弱腸道平滑肌的收縮活動(dòng)。而關(guān)于螞蟥七對(duì)其他影響腸道平滑肌收縮的因素(如鈣離子通道以及組胺受體等)的作用，尚需要進(jìn)一步觀察研究。