王明坤 程 俐 趙 鑫 李愛玲

滕州市中醫(yī)醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2重癥醫(yī)學(xué)科，山東棗莊 277599

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有4.25億2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者，且這一人數(shù)在2045年將達(dá)到6.93億[1]。長(zhǎng)期高血糖的刺激可使T2DM患者出現(xiàn)心血管疾病、高血壓病、糖尿病足等并發(fā)癥[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇，中醫(yī)藥對(duì)T2DM的研究歷史悠久。黃連溫膽湯由溫膽湯化裁而來，首見于《六因條辨》，其治療T2DM效果顯著，但具體作用機(jī)制尚不明確[4-5]。本研究擬借助時(shí)下新興的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology，NP)理論和工具，構(gòu)建“黃連溫膽湯活性成分-T2DM相關(guān)靶點(diǎn)”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，挖掘黃連溫膽湯干預(yù)T2DM潛在機(jī)制，為T2DM的臨床治療和基礎(chǔ)研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 黃連溫膽湯藥物成分篩選

黃連溫膽湯由黃連、半夏、陳皮、枳實(shí)、瓜蔞、茯苓、白術(shù)、丹參、葛根、大黃、黃芩等組成。檢索西北農(nóng)林科技大學(xué)設(shè)計(jì)開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，對(duì)黃連溫膽湯所含藥物的所有成分進(jìn)行挖掘整理[6]。藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是指藥物經(jīng)口服后被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，OB值越高則越有成為治療藥物的潛力；藥物相似度(drug-likeness，DL)是指化合物與已知藥物的相似性。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件[7]，過濾獲得黃連溫膽湯藥物有效成分，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 黃連溫膽湯藥物成分潛在作用靶點(diǎn)收集

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃連溫膽湯藥物成分的潛在作用靶點(diǎn)并導(dǎo)出。登錄UniProt(http：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[8]，以UniProt Knowledgebase(UniProt KB)模塊中“智人(Homo sapiens)”的注釋信息為參照，校正黃連溫膽湯藥物成分潛在作用靶點(diǎn)名稱。

1.3 T2DM靶點(diǎn)的獲取及收集

基因卡片(Gene Cards，https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)系用于分析人類基因數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)集成了約150個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，內(nèi)容涵蓋基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、遺傳等信息[9]。人類在線孟德爾遺傳平臺(tái)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)系記錄人類基因與遺傳表型的數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)是最大的包含人類疾病及相關(guān)基因靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)之一，包含17549種基因和24166種疾病[11]。以“diabetes”“diabetes mellitus”“type 2 diabetes mellitus”作為關(guān)鍵詞檢索上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)合并、去重后，獲得T2DM 的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 黃連溫膽湯干預(yù)T2DM潛在靶點(diǎn)篩選

將檢索獲取的黃連溫膽湯潛在靶點(diǎn)和T2DM相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)站，利用網(wǎng)站的韋恩圖繪制功能(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將黃連溫膽湯潛在靶點(diǎn)和T2DM相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的潛在靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.8.2軟件(http：//www.cytoscape.org)構(gòu)建黃連溫膽湯干預(yù)T2DM 的“藥物- 成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件，以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值為條件，進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選獲得網(wǎng)絡(luò)中的核心成分和靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)顏色越深，代表該靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值越高，在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)信號(hào)通路富集分析

以R語言為平臺(tái)，借助Bioconductor[12]和ClusterProfiler工具[13]，以P<0.05為條件，進(jìn)行黃連溫膽湯干預(yù)T2DM靶點(diǎn)的GO注釋信息和KEGG信號(hào)通路富集分析，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃連溫膽湯有效成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)篩選得到黃連溫膽湯的有效成分有134個(gè)；經(jīng)靶點(diǎn)模型預(yù)測(cè)、匯總并去重后，得到黃連溫膽湯的作用靶點(diǎn)共253個(gè)。通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards平臺(tái)和OMIM平臺(tái)收集得到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)1930個(gè)；將黃連溫膽湯作用靶點(diǎn)和T2DM相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的靶點(diǎn)133個(gè)。見表1及圖1。

表1 黃連溫膽湯有效成分及其干預(yù)T2DM的作用靶點(diǎn)

續(xù)表1

圖1 黃連溫膽湯作用靶點(diǎn)及T2DM相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對(duì)黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制和統(tǒng)計(jì)，得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。經(jīng)拓?fù)浞治?，篩選出黃連溫膽湯干預(yù)T2DM核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3；得到槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)等有效成分以及PTGS1、PTGS2、AR等靶點(diǎn)度值較高。

圖2 黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖3 黃連溫膽湯干預(yù)T2DM核心成分、靶點(diǎn)篩選

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能及通路分析

經(jīng)R語言分析，得到黃連溫膽湯干預(yù)T2DM靶點(diǎn)的GO注釋信息，見圖4。

圖4 黃連溫膽湯干預(yù)T2DM靶點(diǎn)的GO注釋信息

KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果見圖5。

縱坐標(biāo)為信號(hào)通路名稱，橫坐標(biāo)為富集在該通路上的基因數(shù)，顏色越紅代表基因在通路上富集程度越高圖5 黃連溫膽湯干預(yù)T2DM靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

本研究經(jīng)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，槲皮素、木犀草素等有效成分是黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的主要有效成分，PTGS1、PTGS2、AR等基因是黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的核心靶點(diǎn)。經(jīng)富集分析發(fā)現(xiàn)，黃連溫膽湯干預(yù)T2DM的靶點(diǎn)顯著富集于AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路上。

槲皮素廣泛存在于植物中，如蘋果、洋蔥、石榴、山楂等，屬于強(qiáng)抗氧化劑。槲皮素干預(yù)T2DM的作用機(jī)制包括刺激胰島素分泌[14]，對(duì)胰腺或胰島B細(xì)胞的抗氧化和抗炎保護(hù)等[15]。Yao等[16]開展的納入16376人的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)人槲皮素的攝入量與T2DM患病率呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)槲皮素可能有助于降低T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

木犀草素為天然黃酮類化合物，富含于胡椒、芹菜、胡蘿卜和菠菜等食用植物中。α-葡萄糖苷酶是T2DM的關(guān)鍵酶之一。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠以非競(jìng)爭(zhēng)性方式可逆地抑制α-葡萄糖苷酶的催化活性[17]。另有研究證實(shí)，木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷可顯著降低糖尿病模型大鼠血清和肝臟的三酰甘油水平，降低血糖、糖化血紅蛋白的水平，并能減輕胰島素抵抗[18]。木犀草素干預(yù)T2DM的機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。

前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase，PTGS)又稱為環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是花生四烯酸代謝過程中的限速酶，與血小板活性以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型小鼠的血小板COX-1表達(dá)上調(diào)[21]；Finamore等[22]也證實(shí)葡萄糖濃度可影響COX-1 Ser 529殘基的乙?；?，隨著血糖濃度的升高，阿司匹林對(duì)COX-1的抑制作用呈減弱趨勢(shì)。研究表明，二甲雙胍與COX-2抑制劑聯(lián)合使用可以降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和糖尿病患者再入院率，這可能與患者體內(nèi)促炎因子受到抑制有關(guān)[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，木酸可降低糖尿病模型大鼠體內(nèi)COX-2、TNF-α的水平，并抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，通過抗高血脂、保肝、抗氧化和抗炎途徑發(fā)揮干預(yù)糖尿病的作用[24]。COX-1和COX-2與T2DM的相關(guān)性研究較少，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘。

雄激素受體(androgen receptor，AR)屬類固醇受體，研究發(fā)現(xiàn)，AR基因第一外顯子CAG重復(fù)次數(shù)與T2DM男性患者胰島素抵抗和糖化血紅蛋白水平密切相關(guān)[25]。Pujar等[26]利用生物信息學(xué)技術(shù)挖掘發(fā)現(xiàn)，AR與胰島素抵抗關(guān)系密切，可能是胰島素抵抗的核心基因之一。

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是由葡萄糖或其他糖(果糖和戊糖)對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等大分子進(jìn)行翻譯后非酶修飾而形成的異質(zhì)分子。AGEs為有害分子，與T2DM[27]以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡[28]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[29]等免疫疾病密切相關(guān)。AGEs通過與它們的受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合，可以促進(jìn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生[30]。氧化應(yīng)激可以干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)而促進(jìn)病理狀態(tài)的發(fā)生，特別是胰島素介導(dǎo)的代謝反應(yīng)和胰島素抵抗[31]。此外，在與RAGE結(jié)合后，AGEs的積累會(huì)導(dǎo)致高血糖、高脂血癥、炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙等病理反應(yīng)，加重代謝負(fù)擔(dān)[32]。

IL-17由Th17細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和γδT細(xì)胞分泌，通過廣泛存在于胰島細(xì)胞表面的IL-17RA和IL-17RC受體復(fù)合物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可通過直接誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡和增加局部細(xì)胞因子和趨化因子而加重胰島炎癥反應(yīng)[33]。IL-17與1型糖尿病的相關(guān)性已得到證實(shí)[34]；近年來，IL-17在T2DM發(fā)病過程中的重要作用也已得到部分印證。Zhu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中IL-17表達(dá)水平均顯著升高，表達(dá)IL-17的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例與體質(zhì)量指數(shù)和糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)。但I(xiàn)L-17與T2DM的相關(guān)性以及IL-17信號(hào)通路在T2DM發(fā)病過程中的機(jī)制尚未明確，這可能是探索T2DM發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的新途徑。

TNF信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，炎癥反應(yīng)和糖毒性、脂毒性是目前公認(rèn)的導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和損傷的重要因素[36]。研究表明，妊娠期糖尿病患者血清糖化血紅蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1與TNF-α水平較健康妊娠者高，且上述指標(biāo)水平與患者胰島素抵抗呈正相關(guān)，提示TNF-α參與T2DM發(fā)病，且炎癥反應(yīng)可影響胰島素抵抗[37]。另有研究證實(shí)，T2DM患者唾液內(nèi)C反應(yīng)蛋白、IL-6和TNF-α水平高于健康人群，上述炎癥標(biāo)記物與T2DM患者的糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)[38]。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)，黃連溫膽湯中的槲皮素、木犀草素等有效成分可通過干預(yù)PTGS1、PTGS2、AR等基因，調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路，干預(yù)T2DM。上述結(jié)果可為T2DM的治療和基礎(chǔ)研究提供新的思路。