李秋旸，賴艷瓊，楊新杰，龐鵬飛**，王紅斌，張艷麗**，楊文榮

(1.云南民族大學(xué) 生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650500；2.迪肯大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，澳大利亞 吉朗 3217)

藍(lán)藻水華是全球廣泛關(guān)注的水環(huán)境污染問題之一，由于藍(lán)藻毒素的釋放，對公眾健康和水體環(huán)境構(gòu)成巨大威脅.微囊藻毒素（microcystins，MCs）是一種廣泛分布的藍(lán)藻毒素，是由淡水和微咸水中大量繁殖的藍(lán)藻產(chǎn)生，對水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成巨大威脅[1].其中，微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR）是一種環(huán)狀七肽肝毒素，是目前已知毒性最強(qiáng)、危害最大，且最為常見的一種藍(lán)藻毒素[2].微囊藻毒素-LR 含有5 種非蛋白原和兩個(gè)可變位置的亮氨酸（L）和精氨酸（R）（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見附件圖S1），是最早被化學(xué)鑒定和廣泛研究的微囊藻毒素[3-4].長期接觸微囊藻毒素-LR 污染的飲用水或農(nóng)產(chǎn)品可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物肝臟損傷，并通過抑制蛋白磷酸酶1 和2A（PP1 和PP2A）的活性而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5-6].由于毒性強(qiáng)且廣泛存在，1998 年世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中微囊藻毒素-LR 的可接受上限水平為1 μg/L[7].因此，開發(fā)一種簡單、靈敏、快速、可靠的檢測低濃度微囊藻毒素-LR 的分析方法，對保證水質(zhì)和保護(hù)人類健康具有重要意義.

迄今為止，人們已經(jīng)開發(fā)出多種檢測微囊藻毒素-LR 的分析技術(shù)，常見的有高效液相色譜?質(zhì)譜法（HPLC-MS）[8-9]、蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[12-14]及化學(xué)與生物傳感器法[15-25].雖然這些檢測技術(shù)和方法的準(zhǔn)確度和靈敏度較高，但需要昂貴的儀器、訓(xùn)練有素的人員和耗時(shí)的操作過程，意味著其應(yīng)用通常局限于資源充足和集中的實(shí)驗(yàn)室.因此，有必要建立一種簡單、靈敏、特異的微囊藻毒素-LR 檢測方法.近年來，基于抗原和抗體之間高特異性和有效識(shí)別的熒光分析技術(shù)引起研究者的關(guān)注，構(gòu)建不同類型的熒光傳感分析技術(shù)用于微囊藻毒素-LR 檢測[26-29].

金屬納米簇（metal nanoclusters）是一類新型功能納米材料[30]，是由幾個(gè)到幾十個(gè)金屬原子組成的團(tuán)簇，直徑通常小于2 nm.由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如超小尺寸、HOMO-LUMO 躍遷、強(qiáng)的發(fā)光性能及良好的穩(wěn)定性和生物相容性，在生物傳感、催化、標(biāo)記、成像和治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[31].銀納米簇（silver nanoclusters）是一種具有熒光的納米團(tuán)簇[32]，由于其相對簡便的制備方法、超小的尺寸、較強(qiáng)的熒光及熒光量子產(chǎn)率和高穩(wěn)定性，成為目前備受關(guān)注和研究最廣泛的金屬納米簇，已被用于細(xì)胞成像、離子檢測、化學(xué)傳感等領(lǐng)域[33-36].與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料和有毒的熒光量子點(diǎn)相比，銀納米簇具有毒性低、熒光性能穩(wěn)定、生物相容性好、發(fā)射波長可調(diào)和易于制備等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于熒光傳感分析中[32].本研究以微囊藻毒素-LR 適體單鏈DNA 為模板，制備了單鏈DNA-銀納米簇（ssDNA-Ag NCs）熒光探針，構(gòu)建了一種無酶無標(biāo)記檢測微囊藻毒素-LR 的熒光傳感分析新方法，實(shí)現(xiàn)對微囊藻毒素-LR 的快速和超靈敏檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑F-7000 熒光光譜儀（日本株式會(huì)社日立制作所）；TU-1950 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JEM-2100 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；WFH-203B 暗箱式三用紫外分析儀（上海馳唐電子有限公司）；TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）.

微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR，下同.產(chǎn)品編 號(hào)：PN 300632）、微囊藻毒素-RR（microcystin-RR，MC-RR，下同.產(chǎn)品編號(hào)：PN 300636）和微囊藻毒素-LA（microcystin-LA，MC-LA，下同.產(chǎn)品編號(hào)：PN 300628）均購于上海普邁生物科技有限公司；硝酸銀（AgNO3）和硼氫化鈉（NaBH4）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；單鏈DNA 由寶生物工程（大連）有限公司合成并純化，堿基序列詳見表1.所用試劑均為分析純，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步純化，實(shí)驗(yàn)用水為滅菌去離子水.

表1 單鏈DNA 堿基序列Tab.1 Sequence of single-stranded DNA(ssDNA)

1.2 ssDNA-Ag NCs 的制備根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[37]改進(jìn)后制備ssDNA-Ag NCs 熒光探針.以ssDNA的3′-端為模板合成Ag NCs，用pH 7.0 的PBS 緩沖液配制20 μmol/L Aptamer（Apt）溶液（含9 mmol/L Mg2+），按 照nDNA∶nAgNO3∶nNaBH4=1∶6∶6，在250 μL 20 μmol/L Apt 溶液中 緩慢加 入250 μL 120 μmol/L AgNO3溶液，于旋渦震蕩器上劇烈震蕩1 min，室溫下避光反應(yīng)30 min 后，再緩慢加入250 μL 120 μmol/L NaBH4溶液，于旋渦震蕩器上劇烈震蕩1 min，4 ℃下避光反應(yīng)5 h，得到ssDNA-Ag NCs 溶液.

1.3 微囊藻毒素-LR 檢測分析取10 μL ssDNAAg NCs 溶液，用10 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.0）稀釋后，加入不同質(zhì)量濃度的目標(biāo)物MC-LR，37 ℃下培育60 min，測定其熒光光譜.設(shè)置激發(fā)波長為547 nm，掃描560～700 nm 范圍內(nèi)的光譜，掃描速率為240 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為10 nm.

對于實(shí)際水樣的測定，取3 種不同水樣（飲用水、湖水和自來水），用0.2 μm 的濾膜過濾，滅菌處理后，同上方法測定MC-LR 質(zhì)量濃度，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的檢測原理ssDNA-Ag NCs 熒光探針的制備及檢測MC-LR 的原理如圖1 所示.設(shè)計(jì)的適體單鏈ssDNA 既能作為模板合成ssDNAAg NCs，同時(shí)又能與目標(biāo)分析物MC-LR 通過高親合力特異性結(jié)合.合成的ssDNA-Ag NCs 在597 nm處有具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光.當(dāng)存在目標(biāo)分析物MC-LR 時(shí)，由于適體單鏈ssDNA 與MC-LR 之間的特異性親合作用力強(qiáng)于ssDNA 與Ag NCs 的相互作用力，導(dǎo)致Ag NCs 釋放出來，熒光強(qiáng)度減弱.根據(jù)ssDNA-Ag NCs 熒光強(qiáng)度變化與目標(biāo)分析物MC-LR 質(zhì)量濃度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物MCLR 的定量檢測.

圖1 基于ssDNA-Ag NCs 熒光探針檢測MC-LR 原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the detection principle for microcystin-LR based on ssDNA-Ag NCs fluorescent probe

2.2 ssDNA-Ag NCs 的表征采用透射電鏡（TEM）對制備的ssDNA-Ag NCs 進(jìn)行形貌表征，如圖2 所示，ssDNA-Ag NCs 分散度較好，尺寸分布較為均勻，平均粒徑為2 nm 左右（圖2（a））.當(dāng)加入MCLR 后，由于適體單鏈ssDNA 與MC-LR 特異性結(jié)合，導(dǎo)致Ag NCs 釋放出來，且發(fā)生聚集（圖2（b）），表明ssDNA 與MC-LR 的親合力強(qiáng)于Ag NCs.圖3為ssDNA-Ag NCs 的熒光和紫外?可見光譜，曲線a 為ssDNA-Ag NCs 熒光激 發(fā)光譜，激發(fā)波長為547 nm，曲線b 為ssDNA-Ag NCs 熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長為597 nm.ssDNA-Ag NCs 的紫外?可見吸收光譜中，547 nm 處有一個(gè)強(qiáng)的特征吸收峰（曲線c），且與熒光激發(fā)峰對應(yīng).合成的ssDNA-Ag NCs 在365 nm 紫外燈下呈現(xiàn)紅色熒光，在可見光下呈現(xiàn)無色（附件圖S2），與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致.

圖2 Ag NCs 的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of prepared Ag NCs

圖3 ssDNA-Ag NCs 的熒光和紫外?可見光譜圖Fig.3 Fluorescent and UV-vis absorption spectra of ssDNAAg NCs

2.3 熒光猝滅效應(yīng)為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性，我們研究了ssDNA-Ag NCs 熒光強(qiáng)度在加入MC-LR前后的變化.如圖4 所示，當(dāng)不存在MC-LR 時(shí)，ssDNA-Ag NCs 探針在570 nm 處呈現(xiàn)出良好的熒光信號(hào)（曲 線a）；當(dāng)加入500 μg/L MC-LR 時(shí)，ssDNA-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度顯著降低（曲線b）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ssDNA-Ag NCs 可以作為熒光探針，根據(jù)熒光信號(hào)的猝滅程度對MC-LR 進(jìn)行定量分析.

圖4 ssDNA-Ag NCs 的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescent spectra of ssDNA-Ag NCs(a)in absence and(b)in presence of 500 μg/L MC-LR

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化為了獲得最佳的熒光分析性能，對實(shí)驗(yàn)條件（Apt 濃度，探針制備條件，緩沖液pH 值，Mg2+濃度和孵育時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化，如附件圖S3 所示.隨著適體鏈Apt 濃度的增加，ssDNAAg NCs 探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Apt 濃度為20 μmol/L 時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大（附件圖S3A）.因此，實(shí)驗(yàn)選擇20 μmol/L 作為Apt 最佳濃度.AgNO3與NaBH4的加入量影響ssDNA-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度，如附件圖S3B 所示，當(dāng)加入Apt、AgNO3和NaBH4的物質(zhì)的量之比為1∶6∶6 時(shí)，合成的ssDNAAg NCs 熒光強(qiáng)度最大.ssDNA-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度也受到合成時(shí)間影響，當(dāng)合成時(shí)間為5 h 時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度最大（參見資料附件圖S3C）.ssDNAAg NCs 的熒光強(qiáng)度與緩沖液pH 的關(guān)系如資源附件圖S3D 所示，當(dāng)緩沖液pH 為7.0 時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（資源附件S3D）.Mg2+濃度影響DNA 模板法合成Ag NCs 的熒光強(qiáng)度，如附件圖S3E 所示，探針熒光強(qiáng)度隨Mg2+濃度增加而增強(qiáng)，Mg2+濃度為9 mmol/L 時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大.對MC-LR 的檢測，優(yōu)化了ssDNA-Ag NCs 與MC-LR 的孵育時(shí)間，如資源附件圖S3F 所示，隨著孵育時(shí)間的增加，探針熒光強(qiáng)度逐漸減小，當(dāng)孵育時(shí)間為60 min 時(shí)，熒光猝滅效應(yīng)達(dá)到平衡.因此，選擇60 min 作為檢測MC-LR 的最優(yōu)孵育時(shí)間.

2.5 微囊藻毒素-LR 測定在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，測定不同質(zhì)量濃度MC-LR 對ssDNA-Ag NCs探針的熒光猝滅（圖5）.如圖5（a）所示，隨著MCLR 質(zhì)量濃度的增加（0,0.05,0.1,0.5,1,5,20,100,500,1 000 μg/L），ssDNA-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度逐漸減小.ssDNA-Ag NCs 熒光強(qiáng)度的猝滅值與MC-LR質(zhì)量濃度在0.05～1 000 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖5（b）），其線性方程為F=?8.89lg[ρ/(μg/L)]+78.13，檢出限（S/N=3）為16 ng/L，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9912.附件表S1 對比了本工作與已報(bào)道工作檢測MC-LR 的分析效能，由表S1 可見，本工作分析效能與文獻(xiàn)報(bào)道工作相當(dāng)，但本工作具有熒光探針制作簡單、無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn).

圖5 不同質(zhì)量濃度MC-LR 對ssDNA-Ag NCs 探針的熒光猝滅Fig.5 (a)Fluorescent spectra of ssDNA-Ag NCs with different MC-LR concentrations;(b)Relationship between fluorescent intensity of ssDNA-Ag NCs and MC-LR concentrations

2.6 抗干擾實(shí)驗(yàn)為了評(píng)價(jià)ssDNA-Ag NCs 熒光探針的抗干擾能力，考察了水體中MC-LR 共存的2 種異構(gòu)體（MC-RR 和MC-LA）對熒光探針檢測MC-LR 影響.如圖6 所示，當(dāng)MC-LR 質(zhì)量濃度為20 μg/L 時(shí)，5 倍過量的MC-RR 和MC-LA 對熒光探針測定MC-LR 的干擾較小，表明制備的熒光探針具有良好的抗干擾能力，可用于實(shí)際樣品的分析測定.

圖6 ssDNA-Ag NCs 熒光探針的抗干擾實(shí)驗(yàn)Fig.6 Anti-interferent experimental results of ssDNA-Ag NCs fluorescent probe

2.7 實(shí)際樣品測定為了驗(yàn)證該熒光探針對實(shí)際樣品中MC-LR 檢測的可行性，選取3 種水樣（飲用水、湖水和自來水）作為實(shí)際樣品，采用加標(biāo)回收法測定熒光響應(yīng)和回收率.水樣經(jīng)0.2 μm 的濾膜過濾，滅菌處理后，測定其對MC-LR 的熒光響應(yīng)，測定結(jié)果如表2 所示.該熒光探針測定實(shí)際水樣中MC-LR 的回收率為94.0%～106.5%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.34%～2.72%，表明ssDNA-Ag NCs熒光探針對實(shí)際水樣中MC-LR 測定具有可行性.

表2 ssDNA-Ag NCs 熒光探針對3 種實(shí)際水樣中MC-LR的測定結(jié)果Tab.2 Determined results of MC-LR in three real samples using ssDNA-Ag NCs fluorescent proben =3

3 結(jié)論

本文以MC-LR 適體單鏈為模板，成功制備了ssDNA-Ag NCs 無酶無標(biāo)記熒光探針，用于MCLR 的傳感檢測.該適體單鏈既可作為模板合成具有穩(wěn)定熒光的Ag NCs，又能與目標(biāo)物MC-LR 高親和性和高特異性結(jié)合，導(dǎo)致體系熒光猝滅.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ssDNA-Ag NCs 熒光探針制備簡單，且具有良好的生物相容性、高的熒光強(qiáng)度和熒光壽命.根據(jù)熒光猝滅效應(yīng)，建立了熒光法測定MC-LR 的分析檢測方法，該法具有靈敏、無需任何標(biāo)記、操作簡單等優(yōu)勢，為環(huán)境水樣中MC-LR 快速和準(zhǔn)確測定提供新的方法.