王川丕,孫文閃*,周敏,劉芯成,鐘寒輝,董葉箐
綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司(杭州 310051)
2002年瑞典國家食品管理局(Swedish National Food Administration)和斯德哥爾摩大學(xué)(Srockholm University)首次報告油炸或焙烤富含淀粉的食品中含有大量丙烯酰胺,德國、瑞典、比利時、中國、日本、美國、英國等的研究人員也發(fā)表了類似報道,丙烯酰胺對高溫加熱食品的污染引起國際組織和各國政府的高度關(guān)注。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺主要是食物在加熱處理時(大于100 ℃)其天冬酰胺和還原糖通過美拉德反應(yīng)而生成,并且隨著加熱時間延長而增加[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)聯(lián)合協(xié)商報告中指出丙烯酰胺具有潛在的神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性和致癌性[2-4]。因此,建立一種簡單快速靈敏的測定食品中丙烯酰胺的測定方法非常重要。
丙烯酰胺的測定方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[5-8]、液相色譜法[9-12]、氣相色譜法[11-13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[14-18]。液相色譜法靈敏度低且容易受雜質(zhì)干擾,需要較高的濃縮倍數(shù)和復(fù)雜的凈化過程,操作復(fù)雜。液質(zhì)聯(lián)用法雖然具有較高的靈敏度,食品基質(zhì)的復(fù)雜性需要前處理進(jìn)行反復(fù)的凈化,操作繁瑣。氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法需要用到溴試劑衍生問題對試驗操作造成較大困擾。試驗建立一種使用溴化鉀、溴酸鉀和硫酸代替溴試劑的衍生方法,衍生后采用吹掃捕集富集后直接進(jìn)樣,三重四級桿MRM模式測定,同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)效應(yīng)從而為食品中丙烯酰胺的測定提供一個簡單、高靈敏、準(zhǔn)確的分析方法。
GC-2010 plus氣相色譜儀、TQ8040質(zhì)譜儀(日本島津公司);TELEDYNE Tekmar Atomx吹掃捕集儀(美國Tekmar公司);ST16R高速離心機(美國賽默飛世爾公司);硫酸(優(yōu)級純,國藥集團);溴化鉀、溴酸鉀、硫代硫酸鈉(分析純,北京化工廠);標(biāo)準(zhǔn)品丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺(純度>99%,德國Dr Ehrenstofer公司)。
1.2.1 樣品前處理
1.2.1.1 提取
稱取1 g±0.001 g樣品(精確到0.001 g)于50 mL聚丙烯離心管中,加入10.0 mg/L13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液10.0 μL,加入20.0 mL超純水,以2 500 r/min渦旋混合3 min,超聲提取20 min,以8 000 r/min離心5 min,上清液待衍生。
1.2.1.2 衍生
取上述上清液2.00 mL至15 mL離心管,依次加入0.10 mL 10%硫酸溶液,1.0 mL 4.00 mol/L溴化鉀溶液,0.50 mL 0.10 mol/L溴酸鉀溶液,渦旋混勻,于4 ℃條件衍生45 min后,加入0.80 mL 0.20 mol/L硫代硫酸鈉溶液終止衍生反應(yīng),渦旋振蕩至溶液變?yōu)闊o色,將全部衍生液轉(zhuǎn)移到40 mL吹掃捕集瓶內(nèi),用純水定容到刻度混勻,待測定。
1.2.2 吹掃捕集條件
吹掃溫度50 ℃;吹掃流速40 mL/min;吹掃時間10 min;脫附溫度220 ℃;脫附流量300 mL/min;烘烤溫度280 ℃。
1.2.3 色譜條件
DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣,高純氦氣;碰撞氣,高純氬氣,純度≥ 99.999%;柱流量1.0 mL/min。色譜柱程序溫度:65 ℃保持1 min,以15 ℃/min升至200 ℃,以40 ℃/min的速度升至240 ℃,并保持5 min。
1.2.4 質(zhì)譜條件
色譜-質(zhì)譜接口溫度250 ℃;電離方式,EI;離子源溫度250 ℃;檢測器電壓0.99 kV;測定方式,多重反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM);掃描時間5~10 min;定性、定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1,其中*為定量離子對。
表1 丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜檢測參數(shù)
1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制參考文獻(xiàn)[16],用中間溶液配制丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度分別為0.050,0.200,1.00,5.00,20.0和50.0 μg/L,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度1.00 μg/L,現(xiàn)用現(xiàn)配,分別取2.00 mL進(jìn)行衍生,衍生過程同1.2.1。
在(EI)源模式下對丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)衍生物進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,找到母離子,對母離子進(jìn)行二級掃描,根據(jù)二級掃描質(zhì)譜圖,選擇強度最大的2個子離子,設(shè)定3~45 eV進(jìn)行碰撞能量優(yōu)化,優(yōu)化后響應(yīng)最強的離子對作為定量離子對,響應(yīng)次之的為定性離子對。圖1為優(yōu)化后的氣相色譜質(zhì)譜條件采集的丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)衍生物總離子色譜圖。
圖1 丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)衍生物MRM總離子色譜圖
2.2.1 吹掃溫度的優(yōu)化
吹掃的溫度對目標(biāo)物的富集具有重要的作用,比較吹掃溫度25~70 ℃時,50.0 μg/L丙烯酰胺衍生物的峰面積,結(jié)果見圖2。隨著吹掃溫度升高,丙烯酰胺衍生物峰面積增加,達(dá)到50 ℃時,丙烯酰胺衍生物的峰面積達(dá)到穩(wěn)定,因此,確定吹掃溫度為50 ℃。
圖2 吹掃溫度對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
2.2.2 脫附溫度的優(yōu)化
脫附溫度同樣會影響目標(biāo)物的峰面積,比較脫附溫度170~260 ℃對丙烯酰胺衍生物(50.0 μg/L)的峰面積影響,結(jié)果見圖3,丙烯酰胺衍生物的峰面積隨著脫附溫度增加而增大,脫附溫度220 ℃時,峰面積最大,超過220 ℃時,峰面積下降,可能原因為丙烯酰胺衍生物2,3-二溴丙烯酰胺在高溫條件下分解[14],因此,吹掃捕集的脫附溫度定為220 ℃。
圖3 脫附溫度對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
2.2.3 硫酸溶液使用量的優(yōu)化
硫酸溶液的作用是為衍生反應(yīng)提供合適的pH條件,使衍生反應(yīng)達(dá)到最佳效果,其他保持不變的條件下,比較了添加0.06~0.14 mL 10%硫酸溶液對丙烯酰胺衍生物(50.0 μg/L)峰面積的影響,結(jié)果見圖4。10%硫酸溶液體積0.1 mL時,對衍生反應(yīng)最有利,因此確定硫酸溶液的使用量為0.10 mL。
圖4 硫酸溶液用量對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
2.2.4 溴化鉀溶液使用量的優(yōu)化
溴化鉀溶液主要作為反應(yīng)的還原劑,作為溴單質(zhì)生成的來源之一,保持其他不變的條件下,比較了添加0.4~1.4 mL 4.0 mol/L溴化鉀溶液對丙烯酰胺衍生物(50.0 μg/L)峰面積的影響,結(jié)果見圖5。4.0 mol/L溴化鉀溶液體積1.0 mL時,衍生反應(yīng)產(chǎn)物峰面積達(dá)到最大,因此,確定溴化鉀溶液的使用量為1.0 mL。
圖5 溴化鉀溶液用量對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
2.2.5 溴酸鉀溶液使用量的優(yōu)化
溴酸鉀溶液主要作為反應(yīng)的氧化劑,也是溴單質(zhì)生成的來源之一,其他保持不變的條件下,比較了添加0.2~0.7 mL 0.2 mol/L溴酸鉀溶液對丙烯酰胺衍生物(50 μg/L)峰面積的影響,結(jié)果見圖6。溴酸鉀溶液0.5 mL時,衍生反應(yīng)產(chǎn)物峰面積達(dá)到最大值,因此確定溴酸鉀溶液體積為0.5 mL。
圖6 溴酸鉀用量對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
2.2.6 衍生反應(yīng)時間的優(yōu)化
衍生反應(yīng)時間對衍生效果有一定影響,衍生試劑量確定后,比較4 ℃條件下,反應(yīng)時間20~65 min對丙烯酰胺衍生物峰面積的影響,結(jié)果見圖7。衍生反應(yīng)時間45 min時,衍生反應(yīng)產(chǎn)物(50.0 μg/L)峰面積達(dá)到穩(wěn)定,因此,衍生反應(yīng)時間為45 min。
圖7 反應(yīng)時間對衍生產(chǎn)物峰面積的影響
檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)的確定通過樣品加標(biāo)回收,進(jìn)樣分析為3倍信噪比和10倍信噪比,得到分別為0.300和1.00 μg/kg。在1.2.2,1.2.3和1.2.4儀器條件下進(jìn)樣分析,丙烯酰胺的衍生產(chǎn)物在1.00~1.00×103μg/kg范圍內(nèi)的有好的線性關(guān)系,線性方程為y=1.36x-0.212,相關(guān)系數(shù)R2=0.999。
方法的準(zhǔn)確度通過回收率來考察,精密度通過同一濃度平行添加6次回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(SRSD)獲得,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為定量限1.00 μg/kg,10倍定量限10.0 μg/kg,線性范圍最高點對應(yīng)的樣品濃度1.00×103μg/kg。加標(biāo)樣品選擇為餅干、薯條、油炸方便面、面包四種常見油炸或焙烤富含淀粉的食品,回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(SRSD)的結(jié)果見表2。丙烯酰胺在四種基質(zhì)中的回收率(79.2%~92.6%)和精密度(5.17%~9.15%)符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范基本信息 食品理化檢測》的要求。
表2 回收率和精密度試驗結(jié)果
運用該方法對超市隨機購買上的餅干、油炸方便面、油炸薯條、面包等食品進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺的檢出率為100%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.50~723 μg/kg。因此食品生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程需要進(jìn)一步提高技術(shù),控制好溫度和時間,盡可能減少丙烯酰胺的產(chǎn)生,消費者盡量減少食用油炸和烘焙高淀粉類食品。
試驗建立一種使用溴化鉀、溴酸鉀和硫酸代替溴試劑的衍生方法,衍生后采用吹掃捕集富集后直接進(jìn)樣,氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用測定食品中丙烯酰胺,同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法前處理簡單,有機試劑消耗量少,靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確,為食品中丙烯酰胺的測定提供有效的分析方法。