張飛，周漪波，鄧遠強，阮奇珺，付強，鄭家概

廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質快速篩查工程技術研究中心（廣州 510070）

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費和貿(mào)易大國，隨著社會經(jīng)濟飛速發(fā)展，消費者對于魚肉的感官、營養(yǎng)價值和安全性的要求日益提高[1]。新鮮度是衡量魚肉及其制品品質的重要指標之一，它直接決定產(chǎn)品的最終價值[2]。對于某些生食的魚肉產(chǎn)品，其新鮮度還是品質和安全性的重要評價指標。新鮮的魚肉組織細嫩疏松、水分含量較高、內源性蛋白酶豐富，即使在保鮮條件下，仍會發(fā)生一系列的變化，如三磷酸腺苷（ATP）降解、脂肪氧化、微生物滋生等[3-6]?；铘~死后，呼吸作用停止，ATP停止合成，魚肉細胞中的ATP在酶的催化作用下依次降解為二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、肌苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）[7]。Saito等[8]將ATP降解鏈的末端產(chǎn)物（HxR和Hx）總和與ATP及其降解產(chǎn)物的總和的百分比定義為K值，K值可以量化評估魚肉早期的新鮮度[9]。ATP及其降解產(chǎn)物均為極性化合物，有的化合物結構相似，同時分離比較困難，而且魚肉基質復雜，容易受雜質的干擾。目前測定K值的方法有高效液相色譜法、可視化嗅覺技術-HPLC法、濾紙電泳分析法和生物傳感器法等[10-13]。其中最常用的方法是高效液相色譜法，但是分離耗時較長，ATP等化合物容易分解[14]，而且樣品基質復雜，容易干擾目標物。

針對ATP及其降解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和魚肉基質的復雜性，試驗建立了高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質譜同時快速測定ATP及其降解產(chǎn)物的分析方法，通過ATP及其降解產(chǎn)物的含量求得K值。將該方法用于魚肉中K值的測定，初步研究了儲存溫度對魚肉鮮度K值的影響規(guī)律，可為保鮮技術的研究提供數(shù)據(jù)支持，為其他水產(chǎn)品的K值測定提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290Ⅱ/6470A Triple Quard MS超高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（美國Agilent）；BT125D電子天平（德國Sartorius）；?T18 digital ULTRA-TURRAX?均質機（德國IKA）；FB15067型超聲波清洗器（美國Fisher brand）；甲醇（色譜純，Honeywell）；氫氧化鉀、鹽酸、高氯酸（分析純，廣州化學試劑廠）；甲酸、乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。此次研究用水均為一級水，試驗所用活魚樣品為市場購買。

三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、肌苷和次黃嘌呤（≥97%，Sigma）。10%高氯酸溶液和5%高氯酸溶液配制后密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液：稱取適量的ATP、ADP、HxR和IMP，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標準溶液。

稱取適量的AMP和Hx于10 mL容量瓶，加2滴濃鹽酸，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標準溶液。

標準工作液：用水將上述標準儲備液混合并逐級稀釋成質量濃度分別為100，80，50，20，10，5.0和1.0 mg/L系列標準工作液。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）；流動相B：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）/甲醇（1/9，V/V）。梯度洗脫：0～6 min，0% B；6～9 min，0% B～20% B；9～10 min，20% B；10～10.1 min，20% B～0% B；10.1～13 min，0% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長254 nm。

對乙酰氨基酚除了有液體劑型外，還有另外一種劑型——通過肛門給藥的栓劑。在國外，肛門給藥其實很普遍，但我國對于這種方式接受起來還比較困難。但對于有些情況，比如給寶寶喂藥時寶寶會嘔吐，或者夜里發(fā)高燒，不想把寶寶叫醒，這些時候肛門栓劑就會方便很多。

1.3.2 質譜條件

離子源：安捷倫噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；掃描模式：正離子；采集方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣（N2）溫度：350 ℃，流速：7.0 L/min；霧化氣（N2）壓力：40 psi；鞘流氣（N2）溫度：350 ℃，流速：11.0 L/min；毛細管入口端電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；其他質譜采集參數(shù)見表1。

表1 6種化合物的質譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

預處理：將魚去頭尾、去鱗、去內臟，清洗瀝干，去骨取魚肉切成魚片，粉碎均勻后備用。

前處理：稱取2.0 g（精確至0.1 mg）試樣于50 mL具塞離心管，加入20 mL 10%高氯酸提取劑，以10 000 r/min均質1 min，超聲提取5 min，4 ℃下以8 000 r/min離心2 min，取出上清液。再取20 mL 5%高氯酸，清洗均質器刀頭，洗液加到殘渣中。重復上述操作，合并上清液，用水定容。取5 mL上述定容液至10 mL比色管，分別采用3.57 mol/L和1.79 mol/L的氫氧化鉀溶液將其pH調節(jié)至6.0～6.4，再用水定容至10 mL，過濾備用。注意：均質和超聲均在冰水浴下進行。

1.5 K值計算

參照相關文獻[8，10]按式（1）計算K值，單位為百分率。由式（1）可知K值越小，魚肉新鮮度越好。

式中：XATP，XADP，XAMP，XIMP，XHxR，XHx為樣品中ATP，ADP，AMP，IMP，HxR和Hx的含量，mmol/kg。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

由化學結構可知，6種化合物在溶液中均以帶電離子形式存在，因此適用于電噴霧離子源進行離子化。在電噴霧離子源的正、負離子模式下，分別對6種化合物標準溶液進行質譜掃描分析，結果表明在正離子模式下響應較好，信噪比較高，因此選擇正離子模式進行測定，并同時確定了6種化合物的母離子質荷比。通過碎片離子掃描分析，選擇豐度相對較高且穩(wěn)定的碎片離子為定性子離子。最后通過多反應監(jiān)測模式優(yōu)化各項質譜參數(shù)，優(yōu)化結果見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜模式的選擇

2.2.2 色譜柱的選擇

分別選用4種尺寸的C18柱進行分離比對[17]：A柱Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm ×100 mm，2.7 μm）；B柱Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm ×150 mm，2.7 μm）；C柱Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；D柱Ultimate AQ-C18（2.1 mm ×150 mm，3.0 μm）。在同等流動相條件下，B和D柱不能實現(xiàn)IMP，AMP和Hx的良好分離；A柱可實現(xiàn)6種化合物的分離，但色譜峰形較寬，拖尾嚴重；C柱既可實現(xiàn)基線分離，又可使色譜峰形良好，因此選擇C柱。

2.2.3 流動相的選擇

在正離子模式下，流動相中添加揮發(fā)性有機酸可以提高化合物的電離效率，增加質譜響應值，試驗流動相選擇添加甲酸[17]。在反相色譜中，常用的有機相為乙腈或甲醇。選擇乙腈，在梯度洗脫時產(chǎn)生的梯度鬼峰較多，因此選定甲醇作為有機相。

流動相中甲酸和乙酸銨濃度的高低對6種化合物的保留時間和色譜峰形均有影響。通過考察不同甲酸和乙酸銨的濃度，最終確定了最佳流動相條件：流動相A含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液；流動相B含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液/甲醇（1/9，V/V）。通過進一步優(yōu)化梯度洗脫程序，6種化合物在13 min內可實現(xiàn)良好分離，得到的色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的總離子流和紫外色譜圖

2.3 樣品前處理

參考相關標準方法進行前處理優(yōu)化[10]。稱取預處理后的樣品，先進行高速均質，可以快速破壞魚肉細胞和組織，制得勻漿液，再利用超聲提取法充分提取目標物。提取劑選用高氯酸溶液，既可以有效提取目標物，又可以沉淀蛋白質等化合物，減少基質干擾。提取液的pH會影響ATP和ADP色譜峰形和保留時間，因此，需要調節(jié)提取液pH。提取的全過程保持低溫，以減緩ATD和ADP等化合物的降解。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜條件下，對7個水平的系列標準工作液進行測定。以6種化合物的質量濃度為橫坐標，紫外色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。結果表明，ATP和ADP在5.0～100 μg/mL范圍內線性關系良好，其他4種在1.0～100 μg/mL范圍內線性關系良好。當取樣量2.0 g，定容體積50 mL，稀釋一倍時，以3倍和10倍信噪比（S/N）分別計算方法的檢出限和定量限，結果見表2。

表2 6種化合物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 準確度和精密度

試驗選擇石斑魚進行測定，前處理方法參照1.4小節(jié)，ATP、Hx、AMP和HxR添加質量分數(shù)為60～180 mg/kg時，回收率為71%～112%；ADP添加質量分數(shù)為120～200 mg/kg時，回收率為73%～109%；IMP添加質量分數(shù)為1 200～2 000 mg/kg時，回收率為81%～107%。方法的準確度可滿足試驗要求。

平行制備6份供試品溶液，測定供試品溶液中6種化合物的含量，計算求得6種化合物的相對標準偏差（SRSD），結果為8.5%～14.5%。

2.6 實際樣品測定

采用該方法對石斑魚和紅魚的鮮度K值進行測定，并探討在不同溫度下貯藏，魚肉的鮮度K值變化情況。得到的K值的變化規(guī)律見圖2。

由圖2可知：隨著貯藏時間的延長，兩種魚的K值均呈上升趨勢；貯藏溫度越高，兩種魚的K值上升速度越快；6 d后，（-2～2）℃冰晶溫度下貯藏的魚肉K值最高；魚的種類不同，初始K值不同，K值變化的快慢也不同。

圖2 -2～2 ℃，0 ℃和-18 ℃條件下K值變化

3 結論

試驗建立了低溫提取-高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質譜快速測定魚類鮮度K值的分析方法。與現(xiàn)有方法相比[10]，該方法的色譜條件良好、分析時間短、回收率較高，質譜條件可降低基質干擾、定性準確。該方法適用于魚肉中ATP及其降解產(chǎn)物的快速準確定性和定量分析。試驗存在不足之處：ATP和ADP色譜峰拖尾，引起信噪比降低，導致二者檢出限較高。ATP和ADP色譜峰拖尾的原因有：（1）二者均含有堿性氨基，易與固定相殘余的硅羥基發(fā)生作用；（2）儀器中的鋼組件表面涂有金屬氧化物，然而這些金屬氧化物的活性位點易與活性分子相結合。磷酸緩沖液流動相可有效降低上述兩種作用力，然而磷酸鹽是不揮發(fā)鹽，不能用于液相色譜串聯(lián)質譜分析。此外，質譜分析只能用于定性，因為ATP和ADP等化合物在質譜電離過程中就會發(fā)生部分分解，因此采用質譜定量不準確。