石麗莉，鄭 蘇，單舒筠

（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇 徐州 221116）

0 引言

馬鞭草科紫珠屬植物大葉紫珠（Callicarpa Macrophylla Vahl），又名紫珠草、止血草、大葉斑鳩米等，苗藥稱其為“豆嘎先”，是一種野生的常用中草藥；其味辛、苦，性平，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有散瘀止血，消腫止痛之功效，主治衄血、咯血、吐血、便血、外傷出血及跌撲腫痛[1]。大葉紫珠原植物為灌木，在我國廣東、廣西、海南、貴州、云南等省區(qū)均有出產(chǎn)；其葉對生，葉片呈長橢圓形單葉，葉面及葉背均具絨毛，葉背絨毛密生，腺點隱于毛中；其嫩枝呈近四方形，密生灰白色分枝絨毛。民間習用大葉紫珠根、枝、葉入藥，鮮用或曬干；2010年版《中國藥典》將大葉紫珠作為新增中藥品種收錄，記載要求夏秋兩季采摘其葉或帶葉嫩枝，曬干入藥?，F(xiàn)代天然藥物化學研究表明，大葉紫珠中含黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等多種化學成分[2-5]，對大葉紫珠的藥效物質基礎研究大多以止血作用為主，為了更好地開發(fā)利用大葉紫珠的藥用價值，發(fā)現(xiàn)其中的更多活性物質，本實驗著重對大葉紫珠乙醇超聲提取物二氯甲烷萃取層進行了系統(tǒng)的研究，從中分離鑒定出7個單體化合物，分別為urs-12-en-3β-ol 、Oleanic acid 、β-sitosterol 、luteolin 、luteolin -4＇-O-（6＇＇-E-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside 、luteolin -7-O-（6＇＇-E- feruloyl）-β-D- glucopyranoside 、4-methoxybenzoic acid，為大葉紫珠的藥用價值開發(fā)利用提供藥效物質基礎的理論依據(jù)，為藥理藥劑應用研究提供參考。

1 儀器與材料

Bruker-DRX-600型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，四元泵，DAD檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；Buchi R-114旋轉蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；SK250HP超聲波提取器（上?？茖С晝x器有限公司）；Combi Flash Rf 200中低壓快速分離色譜儀（美國Teledyne科技有限公司）；制備型HPLC（Shimadzu，Tokyo，日本）：泵Shimadzu LC-20AR、檢測器Shimadzu SPD-20A、色譜柱Shimpack RP-C18 column （10 μ m， 200 mm× 20 mm）；中壓色譜分離凝膠MCI（德國Merck公司）；薄層層析硅膠板HSGF254，GF254（青島海洋化工有限公司）；凝膠柱層析Sephadex LH-20（美國GE公司）；柱層析填料硅膠（100～200目，青島海洋化工有限公司）；HPLC分析使用色譜純試劑，硅膠柱色譜洗脫等使用分析純試劑。

2 提取與分離

稱取大葉紫珠干燥葉2．5 kg，以適量95%的乙醇超聲提取2次，3 h/次，合并兩次提取液，旋轉蒸發(fā)濃縮至流浸膏，加水混懸。將混懸液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2～3次，將各溶劑層萃取液合并，回收溶劑，濃縮至浸膏狀，真空干燥后記錄各萃取層所得膏體的收率如下：石油醚層為2．9%、二氯甲烷層為50．5%、乙酸乙酯層為3．4%、正丁醇層為22．1%。取二氯甲烷萃取部位，采用硅膠柱色譜進行分離，依次用石油醚∶乙酸乙酯（100∶1→50∶1→30∶1→15∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶5）和乙酸乙酯梯度洗脫，TLC檢測，合并相同 Rf值的流分，得 23 個組分（Fr．1～Fr．23）。Fr．3 有大量物質在甲醇中難溶，過濾得到化合物1（119．6 mg）。Fr．11經(jīng)中低壓快速分離色譜硅膠柱色譜（二氯甲烷∶甲醇，80∶1→1∶1）梯度洗脫后，得到5個組分（Fr．11-1～Fr．11-5）；Fr．11-2（73．1 mg） 經(jīng)凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得化合物Oleanicacid（49．3 mg）。Fr．11-3（178．4 mg）經(jīng)凝膠柱層析，甲醇洗脫后得少量白色粉末，二氯甲烷反復洗滌重結晶純化得化合物β-sitosterol （41．3 mg）。Fr．17經(jīng)中低壓快速分離色譜C18柱色譜（甲醇—水，20%→100%）梯度洗脫后，得到6個組分（Fr．17-1～Fr．17-6）；Fr．17-2 在甲醇中有大量黃色沉淀析出，過濾純化得化合物 luteolin （101．7 mg）。Fr．17-4（254．4 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫后得化合物 luteolin -4＇-O-（6＇＇-E- caffeoyl）-β-D-glucopyranoside （13．2 mg）和化合物 luteolin -7-O-（6＇-E-feruloyl）-β-D- glucopyranoside （28．5 mg）。Fr．19經(jīng)中低壓快速分離色譜C18柱色譜（甲醇—水，40%→100%）梯度洗脫后，得到 5 個組分（Fr．19-1 ～ Fr．19-5），F(xiàn)r．19-4 （192．6 mg） 經(jīng)凝膠柱層析，甲醇洗脫得5個組分（Fr．19-4-1～Fr．19-4-5）；Fr．19-4-4（28．4 mg）經(jīng)制備液相（波長254 nm；乙腈∶0．5%甲酸，62∶38；流速3 mL/min）得化合物 4-methoxybenzoic acid（21．2 mg）。

3 結構鑒定

3.1 化合物1：urs-12-en-3β-ol

化合物1為白色絲狀晶體（二氯甲烷），醋酸酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）譜（圖1）給出1個烯氫多重峰信號5．12（1 H，m，H-12），并且為環(huán)內(nèi)雙鍵；1個連氧叔碳原子上的氫多重峰信號2．46（1 H，m，H-3）；6個甲基單峰氫信號，分別為0．77、0．80、1．07、1．25、4．28、5．08 和 2 個甲基雙峰信號0．93（3 H，d，J=6．0 Hz）、0．87（3 H，d，J=6．0 Hz）。13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）譜（圖2）顯示有30個碳信號。其中，1個連氧碳信號77．3（C-3）；2 個烯碳信號145．2（C-13）、124．5（C-12），提示該化合物為烏蘇-12-烯型五環(huán)三萜類。其余27個碳信號如下：58．9（C-18），55．2（C-5），47．6（C-9），42．0（C-14），41．4（C-22），40．0（C-8），38．8（C-19，20），36．8（C-1），36．4（C-4），34．9（C-10），33．8（C-17），32．9（C-7），31．2（C-21），28．9（C-15），28．6（C-23），28．0（C-28），27．4（C-2），26．6（C-16），23．5（C-11），23．4（C-30），21．7（C-27），18．4（C-6），17．8（C-29），17．0（C-26），16．5（C-25），15．9（C-24）。13C-NMR 譜數(shù)據(jù)與文獻[6]至文獻[9]、文獻[18]、文獻[20]報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為urs-12-en-3β-o（l烏蘇-12-烯-3β-醇）。

圖1 化合物urs-12-en-3β-ol的1H-NMR譜圖

圖2 化合物urs-12-en-3β-ol的13C-NMR譜圖

3.2 化合物2：Oleanic acid

該化合物為白色粉末狀固體，1H-NMR（600 MHz，CH3OH+D2O）譜（圖3）給出 1個羧基上的氫信號5．24（C3-OH）；1個連氧原子上的氫信號分別為5．64（C12-H）；7個甲基單峰氫信號分別為0．94、0．97、1．01、1．07、1．09、1．53、1．55。13C-NMR（ 151 MHz， CH3OH+D2O）譜（圖4）顯示有30個碳信號。其中，1個連甲氧基碳信號23．9（C-3）；1個羧基碳信號180．0（C-28）；其余28個碳信號15．8（C-25），16．3（C-24），17．7（C-26），19．5（C-6），23．9（C-11，16），24．0（C-27），24．5（C-2），26．3（C-15），27．8（C-23），28．7（C-20），31．6（C-7，22，29），33．5（C-21），33．8（C-10），34．9（C-1），38．1（C-4），39．8（C-8），42．7（C-18），42．8（C-14），47．6（C-19），46．6（C-17），48．0（C-9），56．7（C-5），79．7（C-3），123．6（C-12），145．2（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]、文獻[10]至[12]、文獻[20]報道基本一致。故鑒定該化合物為Oleanic acid（齊墩果酸）。

圖3 Oleanic acid的1H-NMR譜圖

圖4 化合物Oleanic acid的13C-NMR譜圖

3.3 化合物3：β-sitosterol

該化合物為白色針狀結晶（ 二氯甲烷），醋酸酐-濃硫酸反應呈陽性。與β-谷甾醇對照品比較，TLC薄層色譜經(jīng)多種展開劑展開，香草醛-濃硫酸反應顯紫色，Rf值及顯色均與對照品顯示一致且混合熔點未下降。該化合物1H-NMR（600 MHz，chloroform）譜圖顯示有 2 個甲基單峰信號0．72（ 3 H，s），1．09（3 H，s）；4個甲基多重峰信號0．88（ 3 H，m），0．92（3 H，m），1．02（3 H，m），1．01（3 H，m）； 1 個烯氫質子多重峰信號5．44（ 1 H，m），1 個連氧次甲基質子多重峰信號3．87（ 1 H，m）；該化合物13C-NMR（151 MHz， chloroform）譜圖顯示 29 個碳信號，根據(jù)分子式計算其不飽和度為 5。其中，13C-NMR（151 MHz， chloroform） 給 出120．75（C-5） 與141．5（C-6）雙鍵信號，70．79（C-3）連氧碳信號。對比文獻[7]中的數(shù)據(jù)，與上述數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為β-sitosterol（β-谷甾醇）。

3.4 化合物4：luteolin

該化合物為黃色粉末狀固體，TLC薄層色譜有紫外吸收。1H-NMR（600 MHz， DMSO）譜低場區(qū)顯示有1個活潑的氫單峰信號12．98（1 H，s，OH-5）；1個氫質子寬雙峰信號7．42（1 H，dd， J = 8．2， 2．2 Hz， H-6＇）；2 個氫質子雙重峰信號7．40（1 H，d，J = 2．2 Hz，H-2＇），6．89（1 H，d，J=8．2 Hz，H-5＇）；1個氫質子單峰信號6．67（1 H，s，H-3）。分析數(shù)據(jù)表明該化合物結構屬B環(huán)上3＇， 4＇位取代的類型；此外，2個氫質子雙重峰信號6．18（1 H，d，J = 2．0 Hz，H-6） 和 6．43（1 H， d，J =2．0 Hz，H-8） 分別表示為A環(huán)上6位和8位質子的間位偶合；該化合物13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）譜給出碳信號163．9（C-2），102．9（C-3），181．6（C-4），157．3（C-5），98．8（C-6），164．1（C-7），93．8（C-8），161．5（C-9），103．7（C-10），121．6（C-1＇），113．4（C-2＇），145．7（C-3＇），149．7（C-4＇），116．0（C-5＇），119．0（ C-6＇）。對比文獻[5]和文獻[13]報道的數(shù)據(jù)與上述數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為luteolin（木犀草素）。

3.5 化合物 5：luteolin -4＇-O-（6＇-E- caffeoyl）-β-D-glucopyranoside

該化合物為黃色粉末狀固體，13C-NMR （151 MHz，DMSO-d6） 與1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） 譜數(shù)據(jù)見表1，與文獻[13]至[16]報道的luteolin-4＇-O-（6＇-E-Caftaril）-β-D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定該化合物為luteolin-4＇-O-（6＇-E-Caftaril）-β-D-glucopyranoside（咖啡酰木犀草苷）。

表1 化合物 5、6 13C-NMR （151 MHz， DMSO-d6）與 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6）數(shù)據(jù)

3.6 化合物 6：luteolin -7-O-（6＇-E- feruloyl）-β-D- glucopyranoside

該化合物為黃色粉末狀固體，13C-NMR （151 MHz，DMSO-d6） 與1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） 譜數(shù)據(jù)見表1，與文獻[13]至[16]報道的luteolin-7-O-（6＇-E- Feruloyl）-β-D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定該化合物為luteolin-7-O-（6＇＇-E- Feruloyl）-β-D-glucopyranoside（阿魏酰木犀草苷）。

3.7 化合物7：4-methoxybenzoic acid

該化合物為白色粉末狀固體，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）譜數(shù)據(jù)有1個羧酸（ -COOH） 中的氫單峰信號11．74（1 H，s）；2個雙重峰信號7．98（ 2 H，d，J=8．8 Hz， H-2，6）、6．97（ 2 H，d，J=8．8 Hz， H-3，5）， 其中7．98（H-2，6）應與羧基直接連接碳原子鄰位的氫，6．97（H-3，5）應與甲氧基直接連接碳原子鄰位的氫；3．83（3H，s， OCH3）應為甲氧基上的甲基氫單峰信號。該化合物13C-NMR（ 151 MHz， CD3OD）譜給出6個碳信號，分別為170．4，164．9，132．9，124．6，115．1，55．3。對比文獻[17]至[20]數(shù)據(jù)，該化合物鑒定為4-methoxybenzoic acid（對甲氧基苯甲酸）。

4 結論

大葉紫珠（Callicarpa Macrophylla Vahl）二氯甲烷萃取物的化學成分研究中得到兩種萜類化合物（1，2），一種甾體化合物（3），三種黃酮類化合物（4，5，6），一種苯甲酸類化合物（7），化合物結構式如圖5所示。

圖5 化合物結構式

中藥材大葉紫珠中含黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等多種類型的化合物[2-5]，其中，文獻檢索頻次及含量較多的為黃酮類和萜類及其苷類。黃酮類成分的抗炎作用、萜類成分的細胞毒活性在抗癌方面的治療效果，均具有很高的藥用價值。為了更深入闡明大葉紫珠的藥效物質基礎，本實驗運用傳統(tǒng)與現(xiàn)代化相結合的分離純化手段，以中低壓快速分離色譜為主，多種色譜方法相結合，建立了一套快速、高效地對大葉紫珠乙醇超聲提取物進行系統(tǒng)研究的工藝方法。下一步將針對大葉紫珠乙醇超聲提取物乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物做系統(tǒng)研究，以期發(fā)現(xiàn)更多其中含有的藥效物質成分。