王曉杰，曲 悅，劉曉蘭

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，齊齊哈爾 161006)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，消費者越來越關(guān)注食品的營養(yǎng)質(zhì)量，以期通過營養(yǎng)食品的攝入促進健康、減少疾病和延長壽命[1]。肽是蛋白質(zhì)的一種特殊存在形式，一般為蛋白質(zhì)降解過程中的中間產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間。通過食物蛋白質(zhì)的酶促水解而衍生的生物活性肽因其促進健康的功能而引起了廣泛的關(guān)注[2]。但是，與內(nèi)源性肽(例如肽激素或信號肽)不同，食物來源的生物活性肽在經(jīng)口服用后必須吸收到血液循環(huán)中，并輸送至靶標才能發(fā)揮其體內(nèi)生物活性[3]。因此，生物活性肽能否被機體消化、吸收與利用，是其在體內(nèi)發(fā)揮健康功效的關(guān)鍵影響因子。

玉米糖肽是玉米蛋白先經(jīng)蛋白酶水解獲得的低分子質(zhì)量玉米肽，再在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)催化下與氨基糖共價結(jié)合的產(chǎn)物。與玉米肽相比，玉米糖肽的溶解性顯著增加，而且具有更高的抗氧化活性及乙醇脫氫酶激活活性[4,5]，是潛在的抗氧化劑和酒精代謝促進劑。研究表明：生物活性肽的結(jié)構(gòu)特性(如分子質(zhì)量大小、帶電性質(zhì)、疏水性等)會影響其在動物胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性及吸收性能，進而影響活性肽的營養(yǎng)質(zhì)量[6,7]。傅里葉紅外光譜的研究結(jié)果表明，在TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)中，D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使玉米肽的結(jié)構(gòu)特性發(fā)生改變[5]，這種改變是否會影響玉米糖肽的營養(yǎng)特性，需要進行深入研究。

本實驗以玉米醇溶蛋白源玉米肽為研究對象，采用D-氨基葡萄糖和TGase對其進行酶法糖基化修飾制備玉米糖肽，采用模擬人體胃腸部消化環(huán)境的體外消化模型和大鼠體內(nèi)實驗，分析玉米糖肽的消化、吸收性能，從營養(yǎng)特性角度去評價玉米糖肽的營養(yǎng)質(zhì)量，為在細胞和動物水平上研究玉米糖肽的健康功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-氨基葡萄糖；堿性蛋白酶Alcalase，酶活力6.28×105U/mL；TGase，酶活力1 000 U/g；玉米醇溶蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；配方鼠糧；SD大鼠。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計，NDA701杜馬斯定氮儀，LD-53真空冷凍干燥機，TGL-16C-W臺式高速離心機，L-8900全自動氨基酸分析儀。

1.3 方法

1.3.1 玉米糖肽的制備

玉米醇溶蛋白用蒸餾水配成底物質(zhì)量濃度為5%的懸浮液，按酶與底物的質(zhì)量比3%加入堿性蛋白酶Alcalase，在初始pH8.5、溫度60 ℃條件下酶解2 h。在酶解過程中，不斷加入1.0 mol/L NaOH使pH保持在8.5。酶解結(jié)束后，反應(yīng)液放入沸水浴中滅酶15 min，冷卻至室溫后將pH調(diào)至7.0，4 000 r/min離心10 min，收集上清液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米肽。將制備的玉米肽配成質(zhì)量分數(shù)為3%的溶液，按玉米肽與D-氨基葡萄糖的質(zhì)量比1∶3加入D-氨基葡萄糖，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.7，按加酶量55 U/g蛋白加入TGase，在44 ℃恒溫水浴振蕩器中糖基化反應(yīng)7 h，85 ℃水浴滅酶5 min。冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過截斷分子質(zhì)量300 u的納濾膜，收集透過液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米糖肽[8]。該方法制備的玉米糖肽中D-氨基葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為(14.92±2.43)%。

1.3.2 玉米糖肽體外營養(yǎng)質(zhì)量的研究

1.3.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定

采用微量凱氏定氮法[9]。

1.3.2.2 肽含量的測定

參照Milán-Carrillo 的三氯乙酸沉淀法[10]，略有修改。將10 mL、10%三氯乙酸溶液與等體積玉米糖肽溶液混合，于25 ℃、120 r/min的恒溫水浴振蕩器中保溫1 h。10 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)質(zhì)量，按式(1)計算肽含量。

(1)

1.3.2.3 體外消化率的測定

一步消化：取10 mL蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/mL的玉米糖肽和玉米肽溶液，將pH調(diào)節(jié)至2.0后加入10 mg胃蛋白酶，于37 ℃條件下消化2 h。

二步消化：制備玉米糖肽和玉米肽的一步消化產(chǎn)物，調(diào)節(jié)消化液的pH至8.0，加入30 mg胰蛋白酶，于37 ℃條件下消化1 h。

一步和二步消化結(jié)束后，反應(yīng)液置于90 ℃水浴中滅酶5 min，冷卻至室溫，再分別加入等體積10% 三氯乙酸溶液，于25 ℃、120 r/min的恒溫水浴振蕩器中振蕩反應(yīng)1 h，10 000 r/min離心10 min，收集一步和二步消化液測定蛋白質(zhì)含量，按式(2)計算體外消化率。

(2)

1.3.2.4 玉米糖肽分子質(zhì)量分布的測定

采用配有凝膠層析色譜柱Superdex Peptide10/300 GL的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)測定。色譜柱先用藍色葡聚糖2000測定外水體積V0，用標準蛋白(aprotinine, 6 500 u；桿菌肽, 1 400 u；氧化型谷胱甘肽, 612 u；還原型谷胱甘肽，307 u)進行校正。以標準蛋白分子質(zhì)量對數(shù)(lgMr)為縱坐標，有效分配系數(shù)[Kaw=(Ve-V0)/(Vt-V0)]為橫坐標繪制標準曲線，y=-3.734 7x+ 4.815 3(R2=0.982)。

將樣品配成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，經(jīng)離心和0.22 μm微孔濾膜過濾后加載于色譜柱。上樣體積100 μL，流速0.25 mL/min，檢測波長214 nm。溶解樣品及色譜柱的平衡和洗脫均采用pH 7.0、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含有0.15 mol/L NaCl)。基于樣品組分的洗脫體積(Ve)計算Kaw及樣品組分的分子質(zhì)量。

1.3.3 玉米糖肽體內(nèi)營養(yǎng)質(zhì)量的研究

1.3.3.1 大鼠氮代謝實驗

采用Mensa-Wilmot的方法進行大鼠氮代謝實驗[11]，略有修改。雌性SD大鼠40只(21日齡)，按體重隨機分為5組：無氮組、玉米醇溶蛋白組、玉米肽組、玉米糖肽組和酪蛋白組。每個實驗組8只大鼠，分別裝進個體代謝籠內(nèi)，飼喂基礎(chǔ)飼料。飼養(yǎng)的方式采用自由飲食和飲水，飼養(yǎng)的環(huán)境條件為：溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，無噪聲，12 h光照/黑暗交替循環(huán)。

開始7 d為環(huán)境及飼料的適應(yīng)期，每只投喂基礎(chǔ)飼料量為15 g/d，2～3次/d。在第8 天清晨撤掉基礎(chǔ)飼料和水，3 h后稱量體重，開始投喂配方飼料，進入5 d的氮代謝實驗。飼料配方參照Wong等[12]描述的化學(xué)成分，如表1所示。氮代謝期內(nèi)，記錄每天每只大鼠所消耗的飼料量，用于對飼料真消化率(TD)、表觀消化率(AD)、凈蛋白利用率(NPUR)和生物價(BV)的測定，計算公式為式(3)～式(6)。

表1 實驗中大鼠飼料的化學(xué)成分

(3)

(4)

NPUR=

(5)

BV=[NPUR-(糞氮量-代謝氮)]×100

(6)

1.3.3.2 大鼠生長實驗

在氮代謝實驗中，每日稱量大鼠體重，并準確記錄每日的飼料添加量及每日實驗結(jié)束時食槽內(nèi)的余料量，計算各處理組實驗動物的體重增加量和總攝食量。按照式(7)和式(8)計算蛋白質(zhì)功效比值(PER)和凈蛋白質(zhì)比值(NPR)，按照式(9)計算校正PER，按照式(10)計算相對NPR。

(7)

(8)

(9)

(10)

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

除氨基酸組成分析外，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，在大鼠氮代謝和生長實驗中n=8，在蛋白質(zhì)和肽含量以及體外消化實驗中n=3。實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0進行單因素方差分析，采用LSD法進行組間多重比較，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米糖肽的基本營養(yǎng)組成

蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)提供氨基酸的能力直接相關(guān)，肽含量與蛋白質(zhì)的消化率和生物利用度直接相關(guān)，兩者均是評價食物中蛋白質(zhì)營養(yǎng)質(zhì)量高低的指標。以玉米肽為對照，測定玉米糖肽的蛋白質(zhì)和肽含量，結(jié)果如表2所示。

表2 玉米糖肽和玉米肽的蛋白質(zhì)和肽含量

由表2所示，與玉米肽相比，玉米糖肽的蛋白質(zhì)含量降低，原因是玉米糖肽分子中共價結(jié)合的D-氨基葡萄糖使得單位質(zhì)量玉米糖肽中蛋白質(zhì)的含量相對降低，但質(zhì)量相對增加。

玉米糖肽和玉米肽的肽質(zhì)量分數(shù)均在75%以上，反映出玉米糖肽和玉米肽均具有較高的生物利用度，因為與大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)相比，小肽不僅可以被動物胃腸道直接吸收，而且還具有促進免疫、抗氧化等生物活性[13]。

2.2 玉米糖肽的分子質(zhì)量分布

采用凝膠色譜法測定玉米肽和玉米糖肽的分子質(zhì)量分布，洗脫圖譜如圖1和圖2所示。

圖1 玉米肽的凝膠色譜洗脫圖譜

圖2 玉米糖肽的凝膠色譜洗脫圖譜

由圖1所示，玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物含有3個分子質(zhì)量組分，分子質(zhì)量主要分布在>6 390 u、6 390～300 u和<300 u范圍內(nèi)。其中，分子質(zhì)量分布在300～6 390 u的組分為玉米肽的主要組分。與圖1相比，圖2所示的玉米糖肽洗脫圖譜整體向左移動，說明TGase催化的D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合和玉米肽分子間的交聯(lián)反應(yīng)使玉米肽的分子質(zhì)量增加。玉米糖肽含有4個分子質(zhì)量組分，分子質(zhì)量主要分布在>6 500 u、6 500～4 259 u、4 259～427 u和<427 u 范圍內(nèi)。其中，分子質(zhì)量>6 500 u肽段的含量是玉米肽的6.99倍，分子質(zhì)量<427 u肽段的含量是玉米肽的5.48倍。一些研究表明，Alcalase同時具有枯草桿菌蛋白酶和谷氨酰胺內(nèi)切蛋白酶活性，可以釋放C末端具有Glu的肽段和疏水性補丁序列，導(dǎo)致生成的肽具有高聚集趨勢[14,15]。在圖1中，玉米肽中分子質(zhì)量<300 u的小肽質(zhì)量分數(shù)僅為4.1%，可能是因為小肽與大肽段發(fā)生了聚集。經(jīng)D-氨基葡萄糖修飾后，<427 u組分含量增加，可能的原因是D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使玉米肽的疏水性降低，同時改善了玉米肽的電荷性質(zhì)，使反應(yīng)體系中靜電排斥作用增強，阻礙了小分子質(zhì)量玉米肽與大肽段的聚集，使小分子質(zhì)量組分含量增加。

2.3 玉米糖肽的體外消化率

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)質(zhì)量和營養(yǎng)狀態(tài)可以根據(jù)蛋白質(zhì)的消化率進行評估，因為消化率的變化可能是由于蛋白質(zhì)質(zhì)量方面的差異導(dǎo)致的。因此，可以用體外消化率表征玉米糖肽的營養(yǎng)質(zhì)量，結(jié)果如表3所示。

表3 玉米糖肽和玉米肽的體外消化率

由表3所示，玉米糖肽及玉米肽的一步和二步體外消化率均大于87%以上，接近于或高于通常被認為是最易消化的蛋清蛋白(88.1%)[16]。玉米糖肽的一步消化率比玉米肽高6.18%，二步消化率比玉米肽高1.72%，說明與玉米肽相比，玉米糖肽更易于消化，可能是由于D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使玉米肽的溶解性相對增加所致。溶解度的增加可以使蛋白質(zhì)具有更高的消化率[17]。含有更多Leu和具有更高總支鏈氨基酸含量的乳清蛋白比酪蛋白和大豆分離蛋白具有更高的體外消化率[18]。玉米糖肽中Leu和總支鏈氨基酸質(zhì)量分數(shù)分別為15.51%和21.91%(數(shù)據(jù)未列出)，因此，玉米糖肽具有與牛乳清蛋白(97.0%)相似的生物利用度[19]，也可能與其氨基酸組成有關(guān)。

2.4 玉米糖肽在大鼠體內(nèi)的營養(yǎng)特性

2.4.1 TD和AD

食物蛋白質(zhì)的TD是反映蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被分解和吸收程度的一項指標。糞代謝量較低，如略去不記的話，則測定的結(jié)果為AD。實驗中采用的4種配法飼料的TD和AD值如表4所示。

表4 4種配方飼料的TD和AD值

由表4可以看出，4種配方飼料對大鼠攝食氮量沒有顯著性影響(P>0.05)，說明添加4種待測原料后，大鼠日糧的適口性和可接受性沒有受到影響，沒有任何適口性介導(dǎo)的采食拒絕，不存在因攝食氮量不同而對氮代謝實驗產(chǎn)生的負面影響。

4種原料的TD和AD值均大于97%以上，說明這4種原料均具有優(yōu)異的消化性能，與動物蛋白如雞蛋(98%)和膠原蛋白(95%)的TD值相當(dāng)[20]。其中，玉米肽組的TD值顯著高于玉米醇溶蛋白組(P<0.05)，且與酪蛋白組相當(dāng)(P>0.05)，說明玉米肽比玉米醇溶蛋白更容易被大鼠消化吸收。與玉米肽組相比，玉米糖肽組的TD值略有下降，但差異不顯著(P>0.05)。Tang等[21]研究了TGase催化的大豆分離蛋白交聯(lián)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)產(chǎn)物的胃蛋白酶消化率下降，但其營養(yǎng)價值和生物利用度與未經(jīng)處理的蛋白相似。蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)可以對蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性產(chǎn)生負面影響，包括營養(yǎng)價值和消化率等[22]。玉米糖肽的TD值略低于玉米肽，可能是由于在玉米糖肽制備過程中，除了D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合反應(yīng)外，玉米肽肽鏈末端的游離-NH2可以與含有Gln殘基的玉米肽分子發(fā)生少量交聯(lián)反應(yīng)，這部分交聯(lián)產(chǎn)物會使玉米糖肽的消化率略有降低。

用4種配法飼料喂養(yǎng)時，大鼠每天的尿氮量間差異不顯著，但糞氮量的組間變化較大。當(dāng)飼料以酪蛋白作為唯一蛋白質(zhì)來源時，大鼠的平均糞氮量低于其他配方飼料，表明酪蛋白具有較高的飲食氮保留率。用玉米醇溶蛋白作為唯一蛋白質(zhì)來源時，大鼠的平均糞氮量高于其他3種配方飼料，表明玉米醇溶蛋白雖然具有較高的消化性能，但是其具有較低的飲食氮保留率，不利于大鼠的生長和發(fā)育。玉米糖肽和玉米肽的糞便氮量與酪蛋白組相比，無顯著性差異，說明玉米糖肽與玉米肽具有與酪蛋白相似的蛋白質(zhì)品質(zhì)。

2.4.2 BV和NPUR

BV是衡量人體從飲食中吸收蛋白質(zhì)效率的指標，一般情況下，營養(yǎng)質(zhì)量良好的食物蛋白質(zhì)的BV在70%～100%之間[23]。NPUR指未考慮在消化過程中沒有吸收而丟失的氮，它將蛋白質(zhì)BV值與消化率結(jié)合起來能更全面的反映蛋白質(zhì)的品質(zhì)。4種配法飼料的BV和NPUR的測定結(jié)果如表5所示。

由表5所示，4種配法飼料的BV值均在90%以上，說明實驗中采用的4種原料均是營養(yǎng)質(zhì)量良好的蛋白質(zhì)，均可以用于蛋白質(zhì)高效飲食的配制。其中，酪蛋白組的BV值最高，被機體的吸收利用率最高。與玉米醇溶蛋白相比，玉米肽和玉米糖肽組的BV值極顯著增加(P<0.01)，但玉米糖肽與玉米肽的BV值之間無顯著性差異(P>0.05)，說明酶法水解改善了玉米醇溶蛋白的機體利用率，而酶法糖基化修飾沒有影響玉米肽的機體利用率，可能與玉米糖肽制備過程中玉米肽分子內(nèi)發(fā)生的少量交聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

表5 4種配方飼料的BV和NPUR值

在NPUR方面，與玉米醇溶蛋白相比，玉米糖肽的NPUR值顯著增加，且玉米糖肽的NPUR值與酪蛋白組相比差異不顯著(P>0.05)，說明酶法水解與酶法糖基化修飾相結(jié)合的方式顯著改善了玉米醇溶蛋白的營養(yǎng)品質(zhì)，玉米糖肽可以被機體充分吸收利用。

2.4.3 大鼠體重增加量、PER和NPR

實驗動物的體重、體長等指標的測量是鑒定蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況的重要依據(jù)。在配方飼料中，以10%的玉米糖肽作為唯一氮源，研究了玉米糖肽攝入對大鼠體重增加量的影響，并根據(jù)體重增加量和攝食氮含量計算了PER，而NPR是在PER的基礎(chǔ)上加上無氮組體重減輕值計算出來的，結(jié)果見表6。

由表6可以看出，4種樣品對實驗動物體重增加量的影響具有顯著性差異，表明這4種樣品維持動物生長的能力不同。隨著實驗的進行，玉米醇溶蛋白組大鼠的體重逐漸下降；玉米糖肽和玉米肽的攝入均使大鼠體重顯著增加，說明玉米醇溶蛋白雖然在大鼠體內(nèi)的消化率高，但氮的被吸收量及吸收蛋白質(zhì)的被利用率低，而經(jīng)酶法水解及酶法糖基化修飾后，玉米醇溶蛋白的營養(yǎng)質(zhì)量顯著改善。

表6 4種樣品對大鼠體重增加量、PER和NPR的影響

在PER方面，酪蛋白組的PER值最高，蛋白質(zhì)利用效率最好，促進了實驗動物的生長發(fā)育。與玉米醇溶蛋白組相比，玉米肽組的PER顯著增加，與玉米肽組相比，玉米糖肽組的PER顯著提高。He等[24]評估了玉米肽與玉米蛋白粉的PER，發(fā)現(xiàn)玉米肽的PER值是玉米蛋白粉的1.72倍，即酶法水解提高了玉米蛋白的生物利用度，與本實驗的結(jié)果一致。酪蛋白的標準PER值為2.5，PER值大于2.5的產(chǎn)品被認為是極好的蛋白質(zhì)來源，玉米糖肽的校正PER為1.60，是玉米肽的1.70倍，說明玉米糖肽是一種良好的蛋白質(zhì)來源，也說明糖基化修飾在一定程度上提高了玉米肽的營養(yǎng)品質(zhì)。PER的差異與蛋白質(zhì)的營養(yǎng)質(zhì)量和含量有關(guān)[28]。在蛋白質(zhì)含量相同的情況下，PER的差異主要與蛋白質(zhì)的營養(yǎng)質(zhì)量有關(guān)。雖然玉米醇溶蛋白的體內(nèi)消化率較高，但氨基酸組成等因素導(dǎo)致其在機體內(nèi)的利用程度及效率低，不能促進動物的生長發(fā)育；與玉米肽相比，玉米糖肽具有更好的營養(yǎng)品質(zhì)，即糖基化修飾使玉米肽的蛋白質(zhì)量提高。

在NPR方面，與玉米醇溶蛋白相比，玉米糖肽和玉米肽的NPR值顯著提高(P<0.05)，且玉米糖肽組的NPR值比玉米肽高25.83%，但兩者間無顯著性差異(P>0.05)。將酪蛋白的NPR校正為100，可以從NPR數(shù)據(jù)中計算出相對NPR。玉米糖肽的相對NPR是玉米肽的1.35倍，表明玉米糖肽在支持斷奶大鼠的生長和營養(yǎng)維持方面比玉米肽更有效，即酶法糖基化修飾可以改善玉米肽的營養(yǎng)品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究主要通過體外模擬胃腸消化以及大鼠氮代謝和生長實驗評價了玉米糖肽的營養(yǎng)特性。玉米糖肽的肽質(zhì)量分數(shù)為78.31%；TD和NPUR分別為(98.54±0.52)%和(95.01±1.61)%，與酪蛋白和玉米肽相比差異不顯著；PER和校正PER值分別為7.02和1.60，NPR和相對NPR分別為9.95和71.79，表明玉米糖肽具有促進動物發(fā)育的作用，是一種良好的蛋白質(zhì)資源。今后可探索玉米糖肽的健康功效，開發(fā)玉米糖肽的產(chǎn)品。