蘇靖元，劉曉蘭, 2，叢珊滋,2，李冠龍

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，齊齊哈爾 161000)(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室2，齊齊哈爾 161000)(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院3，大慶 163000)

我國高血脂癥高發(fā)，并呈現(xiàn)上升趨勢。高血脂癥會誘發(fā)脂肪肝、高血壓、動脈粥樣硬化等多種并發(fā)癥[1,2]。臨床上治療高血脂癥的藥物主要有他汀類、貝特類藥物等，但長期服用會產(chǎn)生一定的副作用，如肝功能異常、肌肉不良反應(yīng)等[3,4]。相比藥物治療，選擇食用拮抗血脂功能的功能食品具有副作用低、安全性強(qiáng)等優(yōu)勢。

發(fā)酵豆制品因其悠久的歷史、獨(dú)特的風(fēng)味和較高的食用價值具有重要的地位。發(fā)酵豆制品富含多種有益人體健康的活性成分，如大豆多肽、大豆異黃酮、γ-氨基丁酸(GABA)、類黑精素、纖溶因子等，具有促進(jìn)脂肪代謝、預(yù)防心血管疾病、抗氧化應(yīng)激、溶栓降壓等功效[5-7]。

微波膨化技術(shù)在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，其具有受熱時間短、物料營養(yǎng)成分破壞少等優(yōu)點[8]。大豆經(jīng)微波膨化處理后，適度增加了體積，保留了原有的形狀；高溫對大豆的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生變化，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、淀粉糊化等，且破壞了抗?fàn)I養(yǎng)因子，有助于提高營養(yǎng)成分的利用率等作用，同時賦予了其特殊的口感和風(fēng)味[9,10]。

本研究以3種膨化原料發(fā)酵豆制品納豆、豆豉和豆醬為原料，建立小鼠高血脂模型，探討其拮抗高血脂癥功效，為拮抗血脂功能食品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

清潔級ICR小鼠(22± 2)g，許可證號：SCXK(吉)2015-0005；高脂飼料由15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、63.6%基礎(chǔ)飼料；大豆、小麥粉：市售；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

P70D20TL-D4微波爐，BSA124S電子天平，SX-500高壓滅菌鍋，CR21G111高速冷凍離心機(jī)，GSP-9270MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，Alphal-4/1sc真空冷凍干燥機(jī)。

1.3 膨化原料發(fā)酵豆制品制備方法

1.3.1 納豆的生產(chǎn)方法

原料預(yù)處理：選擇顆粒飽滿，粒度均勻，無破皮，無褶皺，無霉變，無蟲蛀的小粒大豆。大豆除塵、清洗，浸泡過夜。

整粒微波：將預(yù)處理后的整粒納豆放在微波爐專用保鮮盒內(nèi)。先在120 W功率下微波40 min，再在450 W功率下微波25 min，使大豆既不全部脹開、又有一定體積膨脹度的適度變性，使其水分減少，口感酥脆即可，冷卻至室溫，密封備用。注意膨化時避免局部過熱，導(dǎo)致膨化不均勻。

浸泡：用3倍處理后原料質(zhì)量的水進(jìn)行浸泡，20 ℃恒溫條件下，靜止浸泡1 h，使膨化大豆盡可能充分吸水。

蒸煮：將處理的原料，采用加壓蒸煮方式，將膨化大豆進(jìn)行加壓蒸煮滅菌處理。利用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行蒸煮，加壓0.1 MPa、121 ℃條件下蒸煮15～20 min。熟豆應(yīng)為黃褐色，熟而不爛。冷卻準(zhǔn)備發(fā)酵。

納豆桿菌種子培養(yǎng)液的配制：采用納豆桿菌作為納豆的發(fā)酵菌株，先進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)方法。培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，取一環(huán)菌種，接入裝有初始pH 7.0～7.5的50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)16 h，制備納豆桿菌種子培養(yǎng)液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)處理獲得的原料放入無菌室，冷卻至室溫后接種，按6%的含水量加入無菌水和6%的接菌量，將搖床培養(yǎng)16 h的種子培養(yǎng)液接入原料中，混合均勻，將處理后膨化大豆放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵24 h，將發(fā)酵后的大豆置4 ℃的冰箱中24 h進(jìn)行后熟。

1.3.2 豆豉的生產(chǎn)方法

前處理工藝同1.3.1。

制曲培養(yǎng)：經(jīng)處理獲得的原料冷卻后，將0.2%毛霉菌粉均勻灑在熟料中，翻拌均勻，維持在21～25 ℃，后期注意排水，制曲期間翻曲2次，時間為56～72 h。表面長滿長2 cm左右白色絨毛即可。期間洗曲1次，注意豆曲不宜長時間浸泡在水里，以免含水量增加。

發(fā)酵培養(yǎng)：將處理后曲料加入調(diào)料，放在45 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)入壇密封發(fā)酵。具體調(diào)料配比添加：黃豆100 g，食鹽8 g，白酒3 g，米酒4 g，冷開水5～10 g，總量配成165～170 g。

1.3.3 豆醬的生產(chǎn)方法

前處理工藝同1.3.1。

制曲培養(yǎng)：將經(jīng)處理獲得的原料冷卻后拌入干蒸小麥粉，小麥粉與豆子的質(zhì)量比例是1∶3。接種滬釀米曲霉種曲，接種量為原料質(zhì)量0.2%，注意混勻。制曲采用2日曲，培養(yǎng)箱32～35 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h左右，曲料發(fā)白進(jìn)行第1次翻曲。表面長出綠色絨毛后進(jìn)行第2次翻曲。

發(fā)酵培養(yǎng)：采用固態(tài)低鹽保溫速釀法。以經(jīng)處理獲得的原料與60～65 ℃鹽水混合成固態(tài)醬醅，在45～50 ℃水浴鍋中保溫發(fā)酵，注意用棉塞封口，制成固態(tài)發(fā)酵豆醬。

3種膨化發(fā)酵豆制品冷凍抽干后研磨成粉用于灌胃。

1.4 動物分組及飼喂方法

小鼠適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)分成12組，每組8只，按清潔級動物飼喂，保持實驗室環(huán)境衛(wèi)生，自由飲食，分籠飼喂3周[11]。動物分組及飼喂方法如表1所示。

表1 小鼠分組及飼喂方法

每日稱量并記錄各組小鼠體重，末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，次日稱體重，眼眶取血，靜置后在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min分離血清，將血清保存在-20 ℃冰箱中。解剖小鼠后取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水洗去表面血液，濾紙吸干，稱質(zhì)量，切取一部分肝臟用于制備病理切片，剩下部分用錫箔紙包裹后存放于-80 ℃冰箱中備用。

1.5 指標(biāo)測定

血清指標(biāo)測定：取小鼠血清，按照試劑盒說明書測定血清中TG、TC、LDL-C含量。

肝臟指標(biāo)測定：切取一定質(zhì)量的肝臟，在冰浴條件下用生理鹽水進(jìn)行機(jī)械研磨，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝組織勻漿，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，得到上清液。按照試劑盒說明書的方法測定肝臟組織中MDA含量以及T-SOD活力。

根據(jù)小鼠體重和肝臟質(zhì)量計算肝臟指數(shù)，見式(1)。

(1)

式中：y為肝臟指數(shù)/%；m為肝臟質(zhì)量/g；m0為小鼠體重/g。

1.6 肝臟組織切片觀察

肝臟組織樣品迅速浸泡在體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中，脫水后嵌入石蠟內(nèi)，切成5 μm厚的薄片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行病理組織觀察。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計分析采用SPASS17.0軟件中Duncan’s 檢驗計算統(tǒng)計學(xué)差異的顯著性，P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠高血脂模型的建立

模型組小鼠經(jīng)過連續(xù)3周飼喂高脂飼料后，小鼠的體重、肝臟形態(tài)及血脂含量均發(fā)生顯著改變。與對照組相比，模型組小鼠毛發(fā)雜亂、毛色不夠鮮亮且小鼠活動度減少。對照組小鼠肝臟呈鮮紅色，模型組小鼠肝臟呈土黃色、具有油膩感。與對照組相比，模型組小鼠血清中的TG、TC、LDL-C含量極顯著升高(P<0.01)，分別提高了72.16%、72.78%、169.05%，表明小鼠高血脂模型建造成功。各組小鼠的血脂含量如表2所示。

表2 各處理組小鼠血脂含量(ˉx±s,n=8)

2.2 膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠體重的影響

高血脂癥與肥胖關(guān)系密切，體重指標(biāo)可作為小鼠肥胖程度最直觀的顯示指標(biāo)之一[12]。膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠的體重的影響如表3所示。

表3 膨化大豆原料發(fā)酵豆制品對小鼠體重的影響(ˉx±s,n=8)

由表3可知，小鼠的初始體重基本一致，無顯著差異(P>0.05)。經(jīng)過3周連續(xù)飼喂后，各組小鼠的體重均有不同程度的增加。與對照組相比，模型組小鼠體重增量顯著高于對照組(P<0.05)，增加了161.38%，說明通過高脂飲食可以顯著增加小鼠的體重。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬中、高劑量組體重增量顯著下降(P<0.05)。結(jié)果表明，經(jīng)膳食干預(yù)后，膨化大豆發(fā)酵豆制品對高血脂小鼠的體重增量具有一定的抑制作用，與陽性對照組相一致，且呈良效關(guān)系，可以改善高血脂癥所引發(fā)的肥胖。

2.3 膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠血脂含量的影響

脂類物質(zhì)通過血液運(yùn)輸至機(jī)體內(nèi)各個器官與組織之間，血液中的脂類物質(zhì)含量可以直接反映機(jī)體內(nèi)的脂肪代謝情況[13]。脂類物質(zhì)指標(biāo)包括TG、TC、LDL-C，高于正常水平的TG、TC、LDL-C是高血脂癥的重要指標(biāo)，并可以根據(jù)結(jié)果估計患心血管疾病的風(fēng)險[14]。膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠血脂含量的影響如表4所示。

表4 膨化大豆原料發(fā)酵豆制品對小鼠血脂含量的影響(ˉx±s,n=8)

從表4可以看出，各組小鼠的血脂含量均發(fā)生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠TG、TC、LDL-C水平極顯著增加(P<0.01)，分別提高了72.16%、72.78%、169.05%，說明通過高脂飲食可以改變小鼠的血脂水平。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組TG含量顯著下降(P<0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉高劑量組、豆醬中、高劑量組TC含量顯著下降(P<0.05)，豆豉低、中劑量組及豆醬低劑量組也有所下降但不顯著(P>0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉低、高劑量組及豆醬各劑量組LDL-C含量顯著下降(P<0.05)，豆豉中劑量組及豆醬低劑量組也有所下降，但不顯著(P>0.05)。因此，高脂飲食可以使小鼠血脂水平增加并引起小鼠脂質(zhì)含量異常，通過一定劑量膨化大豆發(fā)酵豆制品的干預(yù)，能夠改善高血脂小鼠的血脂含量，與陽性對照組組相一致，且呈量效關(guān)系，降低發(fā)生病癥的風(fēng)險。

發(fā)酵豆制品富含多種降血脂功能成分，如納豆激酶、GABA、異黃酮類物質(zhì)等。謝嵩等[15]采用納豆對高脂模型大鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各劑量組能夠顯著降低血清中TC、TG的含量，表現(xiàn)出良好的降血脂功效。Yeap等[16]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵綠豆富含GABA，并采用發(fā)酵綠豆、未發(fā)酵綠豆對高脂模型小鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵綠豆降血脂及保護(hù)肝臟能力顯著高于未發(fā)酵綠豆。張亮[17]采用大豆異黃酮對高脂模型大鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各劑量組能顯著降低血清中TC、TG、LDL-C、MDA含量，顯著提高血清中SOD、GSH-PX、T-AOC水平。李曉玲[18]采用大豆異黃酮對蛋雞進(jìn)行膳食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各劑量組能顯著降低血清和蛋黃中TC、TG、LDL-C、MDA的含量。膨化大豆發(fā)酵豆制品具有一定的降血脂功效，可能是由于多種活性物質(zhì)的協(xié)同作用，從而改善血脂異常并起到一定預(yù)防高血脂癥的功效。

2.4 膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

臟器指數(shù)又稱臟體比，是指試驗動物某個臟器質(zhì)量與其體重的比值。肝臟是機(jī)體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的重要器官。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會引起肝臟脂代謝紊亂，脂肪在肝臟過度堆積，導(dǎo)致肝臟重量發(fā)生改變，肝臟指數(shù)也隨之變化，故肝臟指數(shù)可以反映各組小鼠肝臟的損傷程度[19]。膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠的肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響如表5所示。

表5 膨化大豆原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響(ˉx±s,n=8)

從表5可以看出，各組小鼠的肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)發(fā)生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)，分別提高了30.52%、19.77%，表明通過高脂飲食改變了小鼠的肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)，影響了脂肪代謝情況。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組肝質(zhì)量顯著下降(P<0.05)；陽性對照組及各劑量組肝臟指數(shù)有所下降但不顯著(P>0.05)。高脂飲食可以使小鼠肝臟質(zhì)量占比增加并引起小鼠肝臟脂肪堆積，造成肝臟增生肥大。通過膳食干預(yù)，膨化大豆發(fā)酵豆制品可以降低小鼠肝臟內(nèi)部的脂肪蓄積并加速體內(nèi)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄，改善高脂飲食小鼠的肝重及肝臟指數(shù)。

2.5 膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝臟MDA和T-SOD水平的影響

高血脂癥通常伴隨著氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，并引發(fā)機(jī)體抗氧化體系異常，從而加劇高血脂癥進(jìn)一步發(fā)展[20]。MDA是引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物之一，對生物膜系統(tǒng)有破壞作用[21]。因此，MDA含量可以間接反映機(jī)體過氧化損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，具有清除機(jī)體內(nèi)自由基的功能，保護(hù)組織細(xì)胞免受傷害[22]。機(jī)體內(nèi)SOD含量的高低可以反映機(jī)體的抗氧化能力。膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝臟中MDA、T-SOD含量的影響如表6所示。

表6 膨化大豆原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝臟中MDA、T-SOD含量的影響(ˉx±s,n=8)

由表6可知，各組小鼠肝臟中MDA和T-SOD含量發(fā)生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠MDA含量顯著提高了95.98%、T-SOD含量顯著下降了28.43%(P<0.05)，表明高脂飲食可以使機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)發(fā)生改變，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，陽性對照組、豆豉各劑量組、豆醬中、高劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05)，納豆各劑量組及豆醬低劑量組也有所下降但不顯著(P>0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組T-SOD含量顯著提高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，一定劑量膨化大豆發(fā)酵豆制品可以降低由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量，并提高體內(nèi)抗氧化酶活性，與陽性對照組組相一致，且呈量效關(guān)系。

血脂異常導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，氧自由基的增多引起脂質(zhì)過氧化從而加劇高血脂癥。發(fā)酵豆制品富含多種抗氧化功能成分，如類黑精素、異黃酮類物質(zhì)等。Mohd等[23]利用豆豉對肝臟損傷模型小鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，豆豉提取物能夠顯著降低TC、TG、MDA、AST、ALT含量，顯著提高SOD含量，并發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞微泡脂肪變性減少。劉敏等[24]發(fā)現(xiàn)毛霉型豆豉、曲霉型豆豉中的類黑精素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。Ahmad等[25]對未發(fā)酵和發(fā)酵大豆中異黃酮進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過發(fā)酵可以使異黃酮含量增加、抗氧化能力增強(qiáng)。膨化原料發(fā)酵豆制品的抗氧化作用可能是由于類黑精素和大豆異黃酮的協(xié)同作用減緩氧化應(yīng)激，達(dá)到預(yù)防高血脂癥并保護(hù)肝臟的作用。

血脂異常與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)是LDL在大量活性氧的作用下發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，最終產(chǎn)生MDA。OX-LDL也是形成泡沫細(xì)胞的主要因素，而泡沫細(xì)胞是血脂異常階段具有特征性的細(xì)胞，MDA也會促進(jìn)機(jī)體TC積累[26]，從而加劇高血脂癥。

2.6 膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠肝臟組織病理變化的影響

各組小鼠肝臟組織切片如圖1所示。對照組小鼠肝細(xì)胞排列緊密，肝竇清晰可見，未出現(xiàn)脂肪空泡、無脂肪變性和脂肪壞死等現(xiàn)象。模型組小鼠肝細(xì)胞排列松散無序，完整性較差，結(jié)構(gòu)輪廓模糊，有大量脂肪空泡的出現(xiàn)，形態(tài)不完整。與模型組相比，陽性對照組及各試驗組可不同程度改善小鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性，脂肪滴空泡有所減少。結(jié)果表明，膨化原料發(fā)酵豆制品對小鼠脂肪肝變性程度具有改善作用。

圖1 小鼠肝組織HE染色(100×)

3 結(jié)論

本實驗研究了3種膨化大豆發(fā)酵豆制品拮抗高血脂癥功效，研究表明膨化大豆發(fā)酵豆制品均能不同程度改善高血脂癥小鼠的血脂水平及肝臟損傷，降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量，提高機(jī)體的抗氧化能力，達(dá)到拮抗高血脂的功效。膨化大豆發(fā)酵豆制品有一定的拮抗血脂異常作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。