張冬梅 顏浩驍 羅茂林，2 楊 懿 胡一帆 龔晨昕 李志瓊 楊 淞 趙柳蘭*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川特驅(qū)投資集團(tuán)有限公司，成都 611430)

我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國，池塘養(yǎng)殖是我國漁業(yè)的重要組成部分，已經(jīng)成為漁民增收和鄉(xiāng)村振興的主要增長點(diǎn)[1]。但池塘養(yǎng)殖過程中受環(huán)境、營養(yǎng)、病原感染和生長階段等因素的影響，導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病爆發(fā)，甚至造成大規(guī)模死亡，威脅水產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2-3]。因此，如何提高魚體免疫力和抗病力顯得尤為重要。腸道是魚類最大的免疫器官之一[4]，其發(fā)揮著多種作用，例如對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化和吸收、抵抗病原微生物和食物抗原對機(jī)體的影響、參與抗菌肽和攝食調(diào)控類激素的分泌等，一旦腸道功能出現(xiàn)異常，將會(huì)影響影響魚體健康[5-6]。

在傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，通常使用抗生素對疾病進(jìn)行治療，但濫用抗生素，不僅衍生出耐藥性的問題，也會(huì)污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，最終危害人和動(dòng)物的健康。因此，益生菌作為抗生素時(shí)代之后的一種新型飼料添加劑逐漸得到廣泛關(guān)注并成為研究熱點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌是一種在我國已經(jīng)獲得批準(zhǔn)的用于動(dòng)物飼料的微生物菌株，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生產(chǎn)。研究證明，枯草芽孢桿菌可以分泌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和抗生素，從而維持腸道的酸性環(huán)境并抑制病原菌的生長[7-9]。給莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)飼喂補(bǔ)充105或107CFU/g地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)4周后，不僅能提高莫桑比克羅非魚的生長性能，還能改善腸道黏膜、血清免疫參數(shù)和抗氧化活性[10]。在日本鰻鱺(Anguillajaponica)飼料中補(bǔ)充枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)后，其飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高，生長性能和血清非特異性酶活性均得到改善[11]。除此之外，大量研究還發(fā)現(xiàn)益生菌還可以通過調(diào)控炎癥因子表達(dá)和吞噬活性調(diào)節(jié)魚類腸道氧化應(yīng)激和先天性免疫[12-13]，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，隸屬鱸形目(Perciformes)，鱸亞目(Porcoidei)，太陽魚科(Cehtrachidae)，黑鱸屬(Micropterus)，原產(chǎn)于美國，是一種淡水廣溫性肉食性魚類[14]。自20世紀(jì)引入我國以來，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖面積逐年增加，據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，大口黑鱸全國產(chǎn)量為62萬t，已成為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一[15]。近年來大口黑鱸養(yǎng)殖規(guī)模逐年增大，因其肉食性，集約化養(yǎng)殖下其腸道健康問題非常突出，嚴(yán)重限制了產(chǎn)業(yè)發(fā)展[16]。飼料營養(yǎng)不均衡[17]、養(yǎng)殖環(huán)境惡化[5]、缺氧和高溫脅迫等養(yǎng)殖條件[18]等都會(huì)影響大口黑鱸腸道健康。因此，為減少抗生素使用量，保障養(yǎng)殖品安全，在大口黑鱸養(yǎng)殖過程中使用益生菌來改善腸道健康已經(jīng)成為養(yǎng)殖中的重要操作，但是益生菌對魚體腸道健康和腸炎的發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制還需要深入探索。因此，本試驗(yàn)對飼料中添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸生長、腸道組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、免疫能力和腸炎的影響進(jìn)行研究，旨在為大口黑鱸養(yǎng)殖中枯草芽孢桿菌的添加提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚為健康的“優(yōu)鱸1號”大口黑鱸，購于四川某水產(chǎn)有限公司。試驗(yàn)用大口黑鱸商品飼料購自江蘇某飼料有限公司，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌制劑購自上海某生態(tài)工程有限公司，活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/g。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 飼養(yǎng)試驗(yàn)及取樣

本試驗(yàn)設(shè)對照組(基礎(chǔ)飼料)、0.5%枯草芽孢桿菌組(在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%的枯草芽孢桿菌制劑，使飼料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)≥5.0×1010CFU/kg)和1.0%枯草芽孢桿菌組(在基礎(chǔ)飼糧中添加1.0%的枯草芽孢桿菌制劑，使飼料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)≥10.0×1010CFU/kg)。枯草芽孢桿菌添加量參照王成強(qiáng)等[19]的試驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾大口鱸魚幼魚[初始體重(16.0±0.5) g]。試驗(yàn)前，將大口黑鱸暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室塑料桶中，暫養(yǎng)用水為曝氣24 h的自來水，每天換水1/4，水溫(20.0±1) ℃，pH 7.0～8.0，自然光照。每天在09:00和15:00定時(shí)投喂2次，飽食投喂，每天09:30底部吸污排水，采用空氣泵連續(xù)增氧，保持溶解氧濃度8.0 mg/L以上。暫養(yǎng)2周后開始正式試驗(yàn)，正式試驗(yàn)期間的日常管理同暫養(yǎng)期間保持一致，飼養(yǎng)試驗(yàn)持續(xù)6周，于試驗(yàn)初始以及第2周、第4周、第6周進(jìn)行稱重。并且分別計(jì)算所有組的特定生長率(SGR)和增重率(WGR)：

特定生長率(%/d)=[(lnWt-lnW0)/t]×100；增重率(%)=[(Wt-W0)/W0]×100。

式中：Wt為終末體重(g)；W0為初始體重(g)；t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

試驗(yàn)結(jié)束后，所有魚被禁食24 h，于每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)選取9尾試驗(yàn)魚，用200 mg/L MS-222迅速麻醉，測量其體長、體重后每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3尾魚的中腸，10%甲醛固定，用于腸道組織學(xué)觀察；另外的6尾試驗(yàn)魚放入無菌管中，-80 ℃保存，用于腸道免疫和抗氧化指標(biāo)測定。

1.2.2 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)腸炎及取樣

取樣后選擇剩下的試驗(yàn)魚按照Morris等[20]的方法誘導(dǎo)腸炎，以文獻(xiàn)[21]介紹的TNBS適宜劑量(100 mg/kg BW)為基礎(chǔ)，設(shè)置5個(gè)劑量濃度梯度進(jìn)行劑量預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)腸道炎癥癥狀和死亡率確定TNBS誘導(dǎo)腸炎的適宜劑量。用適量的MS-222(60 mg/L)麻醉試驗(yàn)魚3～5 min，注射TNBS前用棉簽刺激肛門，輕輕擠掉后腸末端糞便，以減少糞便對腸道黏液的污染。按照每千克魚體100 mg(TNBS-50%乙醇溶液)的用量將針管(事先磨平，除去尖端)插入肛門上端2 mm進(jìn)行灌注。肛門插管后，魚頭朝下放置10 s，避免灌腸漏肛。每天記錄TNBS誘導(dǎo)的死亡情況，計(jì)算累積死亡率。

累積死亡率(%)=(Nd/Nt)×100。

式中：Nd為累積死亡魚數(shù)；Nt為初始魚數(shù)。

TNBS誘導(dǎo)處理后的第3天，所有魚禁食24 h，于每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)選取9尾試驗(yàn)魚，用200 mg/L MS-222迅速麻醉。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3尾魚的后腸，10%甲醛固定，用于腸道組織學(xué)觀察；剩下的試驗(yàn)魚取全腸放入無菌管中，-80 ℃保存，用于腸道免疫和抗氧化指標(biāo)以及炎性因子表達(dá)測定。

1.3 腸道組織形態(tài)觀察

腸道標(biāo)本用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定，組織病理學(xué)標(biāo)本經(jīng)梯度脫水后石蠟包埋，4 μm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，封片后自然風(fēng)干。采用倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S，Nikon Instruments Inc，日本)進(jìn)行圖像采集，所觀察切片先于低倍鏡下觀察，選擇合適區(qū)域在高倍鏡下采集圖片。用Image Pro Plus軟件對絨毛根數(shù)、高度和寬度及肌層厚度等數(shù)據(jù)進(jìn)行測定。

1.4 腸道生化指標(biāo)檢測

將-80 ℃保存的腸道組織置于冰上進(jìn)行解凍，按照試劑盒說明書往組織中加入適量的組織勻漿液，在1.5 mL離心管中使用碾磨棒充分研磨，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液為組織勻漿液，分裝后于4 ℃冰箱暫存。利用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測定腸道免疫和抗氧化指標(biāo)。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 腸道炎性因子表達(dá)測定

將腸道組織放入研缽內(nèi)，每次加入15 mL的液氮，將組織敲碎，用棒研磨至粉末。用Trizol法(TaKaRa,日本)從腸道組織中提取出總RNA。用1%瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠電泳和NanoDrop 1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)檢測RNA的完整性和濃度。根據(jù)說明書，使用試劑盒(產(chǎn)品編號RR047A，TaKaRa)合成第1鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄方案：37 ℃進(jìn)行15 min；85 ℃持續(xù)5 s。根據(jù)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[5,17]，并結(jié)合本課題組測定的大口黑鱸基因組中的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-15(IL-15)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)基因的編碼序列設(shè)計(jì)PCR引物(表2)，并以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因。PCR程序：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s，62 ℃，30 s，循環(huán)39次；72 ℃，60 s。以二乙基焦碳酸酯(DEPC)水作為陰性對照的模板，每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以避免誤差。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences of PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。在分析之前，檢查數(shù)據(jù)的正態(tài)性和等方差。采用Bonferroni POST檢驗(yàn)，找出3組在某一特定因素上的顯著差異。使用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸幼魚生長性能的影響

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組均未出現(xiàn)死亡情況，存活率均為100%。由表3可知，經(jīng)過6個(gè)周的飼養(yǎng)試驗(yàn)，枯草芽孢桿菌組大口黑鱸的體重、增重率和特定生長率與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸幼魚生長性能的影響Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis on growth performance of juvenile largemouth bass

2.2 注射TNBS后大口黑鱸幼魚的累積死亡率

在本試驗(yàn)中，對大口黑鱸肛門灌注TNBS，并連續(xù)3 d記錄死亡情況。如圖1所示，在注射TNBS后，對照組在第1天即出現(xiàn)死亡情況，且累積死亡率隨時(shí)間的延長迅速上升，0.5%枯草芽孢桿菌組在第2天出現(xiàn)死亡情況，而1.0%枯草芽孢桿菌組在第3天才出現(xiàn)死亡情況。第3天時(shí)，對照組的累積死亡率為33.3%，而2個(gè)枯草芽孢桿菌組的累積死亡率均約為8.3%。

圖1 注射TNBS后大口黑鱸幼魚的累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality of juvenile largemouth bass after TNBS injection

2.3 大口黑鱸幼魚腸道形態(tài)學(xué)觀察和組織病理學(xué)檢查

大口黑鱸幼魚中腸組織結(jié)構(gòu)見圖2，中腸絨毛特征見表4。對照組大口黑鱸中腸腸絨毛較為稀疏、較短，絨毛數(shù)量較少，肌層厚度較窄。而2個(gè)枯草芽孢桿菌組大口黑鱸中腸絨毛纖長緊密、排列整齊，腸絨毛高度、數(shù)量和肌層厚度較對照組顯著增加(P<0.05)。

表4 大口黑鱸幼魚中腸絨毛特征Table 4 Characteristics of midgut villi in juvenile largemouth bass (n=6)

一定劑量的TNBS會(huì)導(dǎo)致硬骨魚的炎癥和組織病理學(xué)惡化。經(jīng)TNBS注射后的組織病理學(xué)檢查和評估(圖3)表明，TNBS誘導(dǎo)的腸炎損害了以絨毛融合、黏膜下層增寬和肌層為特征的腸道結(jié)構(gòu)；同時(shí)，在2個(gè)枯草芽孢桿菌組中，TNBS對后腸的損害明顯減輕。

2.4 大口黑鱸腸道抗氧化指標(biāo)變化

大口黑鱸腸道抗氧化指標(biāo)變化如圖4所示。為期6周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，飼料中添加枯草芽孢桿菌提高了大口黑鱸幼魚腸道總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，其中0.5%枯草芽孢桿菌組GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)，1.0%枯草芽孢桿菌組T-SOD、CAT、GSH-Px活性顯著高于對照組和0.5%枯草芽孢桿菌組(P<0.05)；此外，2個(gè)枯草芽孢桿菌組腸道丙二醛(MDA)含量顯著低于對照組(P<0.05)。經(jīng)注射TNBS誘導(dǎo)腸炎之后，3組大口黑鱸幼魚腸道CAT和T-SOD活性均顯著升高(P<0.05)，對照組和0.5%枯草芽孢桿菌組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，對照組和1.0%枯草芽孢桿菌組MDA含量顯著降低(P<0.05)；0.5%、1.0%枯草芽孢桿菌組大口黑鱸幼魚腸道T-SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著高于對照組(P<0.05)，MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)；同時(shí)，1.0%枯草芽孢桿菌腸道組T-SOD活性還顯著高于0.5%枯草芽孢桿菌組(P<0.05)。

2.5 大口黑鱸幼魚腸道免疫酶活性變化

大口黑鱸幼魚腸道免疫酶活性變化如圖5所示。為期6周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，飼料中添加枯草芽孢桿菌提高了大口黑鱸幼魚腸道免疫酶活性，其中酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)活性隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加顯著升高(P<0.05)，1.0%枯草芽孢桿菌組堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于對照組與0.5%枯草芽孢桿菌組(P<0.05)。經(jīng)注射TNBS誘導(dǎo)腸炎之后，3組大口黑鱸幼魚腸道ACP、LZM和AKP活性均顯著升高(P<0.05)；0.5%、1.0%枯草芽孢桿菌組大口黑鱸腸道ACP、LZM活性均顯著高于對照組(P<0.05)，但二者之間并沒有顯著差異(P>0.05)，而AKP活性則隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而顯著升高(P<0.05)。

A:對照組 control group;B:0.5%枯草芽孢桿菌組 0.5% Bacillus subtilis group;C:1.0%枯草芽孢桿菌組 1.0% Bacillus subtilis group。下圖同 the same as below。圖2 大口黑鱸幼魚中腸組織結(jié)構(gòu) Fig.2 Histological structure of midgut in juvenile largemouth bass (100×)

紅色箭頭代表絨毛萎縮；黃色箭頭代表腸上皮細(xì)胞壞死。Red arrow represented atrophy of villi; yellow arrow represented intestinal epithelial cell necrosis.圖3 注射TNBS后大口黑鱸幼魚后腸組織病理學(xué)觀察Fig.3 Histopathological observation of hindgut in juvenile largemouth bass after injection of TNBS (100×)

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示注射TNBS前不同組之間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注不同大寫字母表示注射TNBS后不同組之間差異顯著(P<0.05)。*表示同一組內(nèi)注射TNBS前后差異顯著(P<0.05)。圖5同。Value columns with different small letters mean significant difference among different groups before TNBS injection (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference among different groups after TNBS injection (P<0.05). * mean significant difference between before and after TNBS injection in the same group (P<0.05). The same as Fig.5.圖4 大口黑鱸幼魚腸道抗氧化指標(biāo)變化Fig.4 Changes of intestinal antioxidant indices in juvenile largemouth bass

圖5 大口黑鱸幼魚腸道免疫酶活性變化Fig.5 Changes of intestinal immune enzyme activities in juvenile largemouth bass

2.6 大口黑鱸腸道炎性因子表達(dá)

TNBS觸發(fā)腸道炎癥的最典型的炎癥反應(yīng)特征是促炎因子表達(dá)增加，抗炎因子表達(dá)下降。本試驗(yàn)檢測了TNBS誘導(dǎo)腸炎后大口黑鱸腸道中炎性因子的mRNA相對表達(dá)量，如圖6所示。與對照組相比，0.5%、1.0%枯草芽孢桿菌組大口黑鱸幼魚腸道促炎因子IL-1β、IL-15、TNF-α、IL-8的mRNA相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，抗炎因子IL-10、TGF-β1的mRNA相對表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，說明枯草芽孢桿菌能有效調(diào)節(jié)TNBS誘導(dǎo)腸炎后炎性因子的表達(dá)。

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌對大口黑鱸幼魚生長性能的影響

有研究表明，飼料中添加適量的芽孢桿菌能夠提高消化酶活性，減少抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進(jìn)魚體的生長[22-23]。但從本研究的試驗(yàn)數(shù)據(jù)看，各組大口黑鱸幼魚的生長性能沒有顯著差異，且均低于生產(chǎn)實(shí)踐中的生長性能。推測其原因可能是在為期6周的養(yǎng)殖過程中，一直采用每天定時(shí)投喂2次的方式，而生產(chǎn)上在養(yǎng)殖初期每日投喂3次，然后隨著魚類生長調(diào)整為每日2次。投喂次數(shù)減少可能降低了試驗(yàn)魚的采食量，影響了生長性能。

3.2 枯草芽孢桿菌促進(jìn)大口黑鱸幼魚腸道健康

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).圖6 飼糧中添加枯草芽孢桿菌對TNBS注射后大口黑鱸腸道炎性因子表達(dá)的影響Fig.6 Effects of dietary Bacillus subtilis on expression of intestinal inflammatory factors of juvenile largemouth bass after TNBS injection

氧化應(yīng)激是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)羥基自由基和超氧陰離子等自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面影響，易引起機(jī)體衰老與疾病[26-27]。動(dòng)物機(jī)體中存在著2種抗氧化物，一類是酶類抗氧化物，另外一類是非酶類抗氧化物，其作用是清理動(dòng)物體內(nèi)的過氧化物，以保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激帶來的損傷。酶類抗氧化物的種類繁多，常見的幾種有CAT、超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px[28]。研究已經(jīng)證明，動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶是應(yīng)激和免疫反應(yīng)生物標(biāo)志物，其活性決定了動(dòng)物的抗氧化能力，可以作為評估魚類健康的指標(biāo)[29-30]。本研究測定了大口黑鱸幼魚腸道的抗氧化酶活性，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌組的T-SOD、CAT和GSH-Px活性顯著增加，這表明枯草芽孢桿菌可以增強(qiáng)大口黑鱸幼魚的抗氧化能力。MDA是由生物膜中多不飽和脂肪酸氧化而產(chǎn)生的，動(dòng)物體內(nèi)MDA的含量可以直接反映脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞受損的情況，MDA含量高，說明細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜添加量的枯草芽孢桿菌能顯著降低大口黑鱸幼魚腸道中MDA含量。這與其他研究人員對其他水產(chǎn)動(dòng)物所得結(jié)果一致，在對羅非魚[32]、克氏原螯蝦(Procambarusclarki)[33]的研究中均發(fā)現(xiàn)了在飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠使得抗氧化酶活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明組織抗氧化能力被提高。

魚類自身的免疫系統(tǒng)可以有效抵抗生活環(huán)境中病原微生物的入侵，以保證各項(xiàng)生理功能正常運(yùn)行[34]。LZM、AKP和ACP是魚類重要的非特異免疫酶，在參與機(jī)體的代謝和免疫方面發(fā)揮著重要作用，是衡量機(jī)體免疫能力的標(biāo)準(zhǔn)[35]。在本研究中，與對照組相比，枯草芽孢桿菌添加顯著提高了大口黑鱸幼魚腸道LZM、ACP和AKP活性。類似地，在軍曹魚(Rachycentroncanadum)[36]、鴨嘴鯰(Pseudoplatystomafasciatum)[37]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[38]中研究也發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌會(huì)顯著影響其免疫酶活性。這表明枯草芽孢桿菌能夠增強(qiáng)魚類腸道的免疫能力。

3.3 枯草芽孢桿菌緩解大口黑鱸幼魚腸炎

在魚類的免疫應(yīng)答中，通常以抗病能力作為益生菌的選擇標(biāo)準(zhǔn)[39]。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，腸炎問題頻發(fā)，為了研究腸炎的免疫發(fā)病機(jī)制，人們建立了實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，常用于評估新的抗炎策略[40-41]。使用最廣泛的模型之一是由TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，其簡便易行、易于復(fù)制，是一種較為理想的腸炎動(dòng)物模型。TNBS觸發(fā)腸道炎癥的可能機(jī)制是導(dǎo)致上皮單層襯里破裂，誘導(dǎo)細(xì)菌侵入黏膜并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，其典型的炎癥反應(yīng)特征是促炎因子表達(dá)增加，抗炎因子表達(dá)下降[42]。在本研究中，投喂了枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)魚在注射TNBS后顯示出較高的存活率。組織病理學(xué)檢查和評估表明，TNBS誘導(dǎo)的腸炎損害了以絨毛、黏膜層和肌層為特征的腸道結(jié)構(gòu)。然而，飼料中添加枯草芽孢桿菌明顯減輕了TNBS誘導(dǎo)的腸道損害。與本研究結(jié)果一致，Daniels等[24]和Asaduzzaman等[43]分別對歐洲龍蝦和吉羅羅非魚(Tortambroides)進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)益生菌能夠保護(hù)動(dòng)物的腸道。這表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高大口黑鱸幼魚的存活率，維護(hù)機(jī)體注射TNBS后的腸道正常組織結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸道免受TNBS帶來的損傷。

此外，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)注射TNBS誘導(dǎo)腸炎后增加了腸道抗氧化酶和免疫酶的活性，并且，枯草芽孢桿菌組的腸道抗氧化酶和免疫酶活性均高于對照組，這表明枯草芽孢桿菌可以通過增加腸道抗氧化酶和免疫酶的活性增強(qiáng)其抗氧化能力和免疫能力，降低TNBS對腸道的損傷。這與前人的研究結(jié)果一致，Ring?等[44]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)可以增加錦鯉的體重，提高錦鯉對病毒感染的抵抗能力和免疫能力；宮秀燕等[45]發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌感染可降低肉雞的抗氧化能力，而飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌能夠通過提高肉雞的抗氧化能力而緩解因腸炎沙門氏菌感染所造成的氧化應(yīng)激。綜上可知，在飼料中加入適量的枯草芽孢桿菌能夠增強(qiáng)魚類抗氧化能力和免疫能力，從而增強(qiáng)其對疾病的抵抗力。

細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在魚類機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用，其可以通過增強(qiáng)或抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[46]。根據(jù)細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用，魚類的細(xì)胞因子可以分為抗炎因子(如IL-10和TGF-β1等)和促炎因子(如TNF-α、IL-1β、IL-15和IL-8等)[47]。腸炎會(huì)增加促炎因子的表達(dá)，降低抗炎因子的表達(dá)，因此它們能夠在分子水平上指示炎癥性損傷[48-49]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過調(diào)控炎癥因子表達(dá)調(diào)節(jié)魚類腸道先天性免疫，增強(qiáng)魚體對致病菌的抵抗能力，從而減緩炎癥[45,50]。但目前關(guān)于枯草芽孢桿菌對注射TNBS后大口黑鱸幼魚腸道炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)還尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出顯著降低大口黑鱸幼魚腸道促炎因子IL-1β、IL-15、TNF-α、IL-8的mRNA相對表達(dá)量，并顯著升高抗炎因子IL-10、TGF-β1的mRNA相對表達(dá)量。與本研究結(jié)果一致，Midhun等[51]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌可以顯著上調(diào)羅非魚免疫相關(guān)基因及IL-10等抗炎因子的表達(dá)。我們推測，枯草芽孢桿菌對炎性因子表達(dá)的影響可能部分歸因于核因子-κB(NF-κB)信號通路。已有研究發(fā)現(xiàn)，在人類中，NF-κB可以促進(jìn)IL-1β、TNF-α和γ-干擾素(IFN-γ)的表達(dá)，而抑制IL-10的表達(dá)[52]。促炎因子(IL-1β、IL-8、TNF-α等)mRNA相對表達(dá)量與NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)，所以枯草芽孢桿菌組較低的促炎因子IL-1β、IL-8、IL-15和TNF-αmRNA相對表達(dá)量可能部分與該魚腸道NF-κB p65轉(zhuǎn)錄豐度降低有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌增強(qiáng)了大口黑鱸幼魚腸道IL-10和TGF-β1的表達(dá)，猜測這可能是通過其他信號途徑發(fā)揮的作用，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。綜上可知，適宜添加量的枯草芽孢桿菌可以改善TNBS注射后大口黑鱸幼魚腸道的炎癥狀態(tài)，從而降低TNBS引起的腸道損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加枯草芽孢桿菌可以有效改善大口黑鱸幼魚的腸道抗氧化能力和免疫能力。在注射TNBS誘導(dǎo)腸炎后，1.0%枯草芽孢桿菌對于大口黑鱸幼魚腸炎的緩解作用更佳，可作為生產(chǎn)參考用量。