牛金玲 劉永需 李福昌 劉 磊*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271000；2.青島康大食品有限公司，青島 266555)

仔兔斷奶后并行換料(由斷奶前吃母兔料改為仔兔料)，雙重應(yīng)激造成仔兔胃腸道功能紊亂，導(dǎo)致腹瀉率增長(zhǎng)，嚴(yán)重影響家兔養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益?？股氐拇罅渴褂?、藥物殘留及耐藥菌株的產(chǎn)生等問(wèn)題嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品質(zhì)量，食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到消費(fèi)者的關(guān)注。因此，綠色、安全的飼料添加劑得到了畜牧養(yǎng)殖者的認(rèn)可。抗菌肽是宿主先天性免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽，多為陽(yáng)離子多肽，具有廣譜抗菌性、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)殘留等特點(diǎn)[1]。牛至精油是一種植物提取物，具有天然香辛味，具有刺激動(dòng)物消化酶分泌、增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力、減少腸道疾病等作用[2]。飼糧中添加牛至精油能提高家兔的抗氧化性能[3]，本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)研究了不同劑量的牛至精油對(duì)肉兔腹瀉的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.08%的牛至精油對(duì)肉兔的腹瀉有很好的改善效果[4]?？咕娘暳咸砑觿?yīng)用較為廣泛，飼糧中添加0.15%以上的抗菌肽能顯著提高肉兔的平均日增重，改善飼料轉(zhuǎn)化效率[5]。先前研究主要集中在對(duì)牛至精油和抗菌肽在肉兔飼糧中的單一應(yīng)用，但對(duì)于牛至精油和抗菌肽聯(lián)合使用的研究較少。因此，本試驗(yàn)在肉兔飼糧中聯(lián)合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽，研究其對(duì)斷奶后肉兔腹瀉率及腸道屏障的影響，為牛至精油和抗菌肽在生長(zhǎng)肉兔生產(chǎn)中的聯(lián)合應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

324只體重相近的健康斷奶肉兔(38日齡)免疫后(兔瘟)隨機(jī)分為2組(每組9個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18只兔)：對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1)，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中聯(lián)合添加0.08%的牛至精油(純度5%)和0.15%的抗菌肽(純度0.4%，主要成分是植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物，核心代謝產(chǎn)物為腸桿菌肽)。試驗(yàn)過(guò)程中每天早上進(jìn)行消毒，兔舍自然采光和通風(fēng)，自由采食和飲水，統(tǒng)計(jì)整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)的采食量、體增重和腹瀉情況，并計(jì)算料重比(平均日采食量/平均日增重)和腹瀉率(發(fā)生腹瀉的只數(shù)/總只數(shù)×100)。試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)組選取8只兔(公母各占1/2)進(jìn)行屠宰，分離小腸各腸道用多聚甲醛固定用于制作切片，另分離空腸和回腸黏膜組織于液氮中，用于RNA提取和免疫指標(biāo)測(cè)定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 腸道屏障指標(biāo)測(cè)定

將采集小腸各段的樣品進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色法進(jìn)行染色，待組織切片干燥后，置于顯微鏡觀察。測(cè)定絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。

1.3 總RNA的提取與基因表達(dá)

RNA采用Trizol法提取，用瓊脂糖凝膠電泳和生物分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。按照寶生物工程(大連)有限公司的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒操作說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR，PCR正向、反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)，0.4 μL ROX燃料(50×)，2 μL cDNA模板和6.8 μL雙蒸水。PCR循環(huán)參數(shù)為：95.0 ℃預(yù)變性10 s；95.0 ℃變性5 s，60 ℃延伸和退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因相對(duì)表達(dá)量使用2-△△Ct方法計(jì)算。內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters

1.4 免疫屏障指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定肉兔的空腸和回腸組織中白細(xì)胞介素-10(IL-10)、分泌型免疫球蛋白G(SIgG)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，采用上海恒源生物有限公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)使用Excel 2000進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)生長(zhǎng)肉兔生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，抗菌肽和牛至精油聯(lián)合飼喂顯著增加了肉兔平均日增重(P<0.05)，而對(duì)平均日采食量無(wú)顯著影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，聯(lián)合添加抗菌肽和牛至精油顯著降低了肉兔料重比和腹瀉率(P>0.05)。

表3 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on growth performance in meat rabbits

2.2 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道機(jī)械屏障的影響

由表4可知，飼糧聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)肉兔空腸的隱窩深度、VH/CD影響均不顯著(P>0.05)，但顯著增加了空腸的絨毛高度(P<0.05)；對(duì)肉兔回腸隱窩深度影響不顯著(P>0.05)，但顯著增加了回腸的VH/CD(P<0.05)。

表4 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)肉兔腸道黏膜發(fā)育的影響Table 4 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on intestinal mucosal development in meat rabbits

由表5可知，飼糧聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)肉兔空腸閉鎖蛋白(Occludin)、閉合小環(huán)蛋白1(ZO1)和閉合小環(huán)蛋白2(ZO2)基因相對(duì)表達(dá)量影響不顯著(P>0.05)，卻顯著增加閉合蛋白1(Claudin1)和連接黏附分子3(JAM3)基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；在回腸中，飼糧聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽顯著降低了回腸中Claudin1基因表達(dá)相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)肉兔回腸Occludin、ZO1、ZO2和JAM3基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)肉兔空腸和回腸機(jī)械屏障基因相對(duì)表達(dá)量的影響Table 5 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on relative expression level of intestinal gene related mechanical barrier in meat rabbits

2.3 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽復(fù)合對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道免疫屏障指標(biāo)的影響

由表6可知，飼糧聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽顯著降升高了空腸中IL-10的含量(P<0.05)，卻顯著降低了空腸中TNF-α的含量(P<0.05)，而對(duì)空腸中SIgG的含量無(wú)顯著影響(P>0.05)；在回腸中，飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽顯著升高了SIgG的含量(P<0.05)，而對(duì)IL-10和TNF-α的含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道免疫屏障指標(biāo)的影響Table 6 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on intestinal immune barrier indexes in meat rabbits

3 討 論

3.1 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽復(fù)合對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響

牛至精油是一種較為典型的植物提取物，能夠改善機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能。有研究結(jié)果表明，在母豬飼糧中添加牛至精油，能夠提高仔豬生長(zhǎng)速度[6]?？咕氖且活惥哂袕V譜抗菌活性的多肽類物質(zhì)，在飼糧中添加抗菌肽可顯著提高仔豬和肉仔雞的平均日增重和采食量，從而提高了生產(chǎn)性能[7-8]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，聯(lián)合添加0.15%抗菌肽與0.08%牛至精油雖然對(duì)平均日采食量無(wú)顯著影響，但顯著提高了肉兔的平均日增重，提高了飼料轉(zhuǎn)化效率，這可能與試驗(yàn)組肉兔對(duì)飼糧的吸收效率有關(guān)，植物精油能增加膽鹽的分泌，提高腸黏膜和胰腺的酶活性[9]。

腹瀉是兔場(chǎng)的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響肉兔的生長(zhǎng)性能，先前的眾多研究發(fā)現(xiàn)牛至精油和抗菌肽在畜禽腸道健康中有一定的調(diào)節(jié)作用。先前研究表明，飼糧中添加單一牛至精油，能顯著降低仔豬和蛋雞的腹瀉率[10-11]。飼糧中添加抗菌肽也可顯著降低仔豬的腹瀉率[12]。先前試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽能顯著減低肉兔的死亡率[4]。本試驗(yàn)中，飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽后，肉兔的腹瀉率由原來(lái)的25.93%降為12.35%，效果較為明顯，其主要原因可能與牛至精油和抗菌肽添加后腸道免疫機(jī)能增強(qiáng)有關(guān)。

3.2 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽復(fù)合對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道機(jī)械屏障的影響

絨毛高度和隱窩深度是衡量小腸吸收能力的重要指標(biāo)，絨毛高度越高，小腸的吸收面積越大，VH/CD越大，肉兔對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力越強(qiáng)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油可以提高肉雞回腸絨毛高度以及VH/CD[14]。Tekce等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激的條件下使用牛至精油，仍然可以改善肉雞的小腸絨毛高度和隱窩深度。有研究發(fā)現(xiàn)，使用抗菌肽與玉屏風(fēng)散聯(lián)合應(yīng)用沒(méi)有顯著影響腸道絨毛發(fā)育，對(duì)肉雞營(yíng)養(yǎng)消化沒(méi)有影響[16]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽可以顯著增加空腸及回腸的絨毛高度，顯著提高VH/CD，聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽在一定程度上改善了肉兔的腸道形態(tài)發(fā)育，提高了肉兔的消化吸收能力。

腸道黏膜通透性也是腸道機(jī)械屏障的一個(gè)重要組成部分，緊密連接蛋白是構(gòu)成腸道物理屏障和細(xì)胞旁通透性的關(guān)鍵決定因素[17]。大約有50種蛋白質(zhì)參與緊密連接的形成，主要為Occludin、Claudins和JAM 3種完整的跨膜蛋白和ZO。這些跨膜蛋白(Occludin、Claudins和JAM)的胞外域與相鄰細(xì)胞構(gòu)成選擇性屏障，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附、移動(dòng)及細(xì)胞的通透性，而胞內(nèi)域則與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ZO相連。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用牛至精油以及抗菌肽顯著提高了肉兔空腸Claudin1和JAM3基因相對(duì)表達(dá)量，提示聯(lián)合添加牛至精油以及抗菌肽能夠改善空腸的通透性，增加了機(jī)械屏障功能。在回腸中，飼糧中添加牛至精油和抗菌肽對(duì)Claudin1基因相對(duì)表達(dá)量的影響與空腸中相反，表明牛至精油和抗菌肽對(duì)腸道Claudin1基因相對(duì)表達(dá)量具有位置特異性，具體機(jī)制尚未清楚。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)回腸中所測(cè)機(jī)械屏障相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響，說(shuō)明聯(lián)合添加牛至精油以及抗菌肽對(duì)小腸后端機(jī)械屏障的影響不顯著。

3.3 飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道免疫屏障的影響

腸道具有大量的微生物以及眾多的免疫細(xì)胞，被稱為動(dòng)物的“天然屏障”，是動(dòng)物體最大的免疫器官。腸道免疫屏障主要由腸黏膜固有層、淋巴細(xì)胞以及腸道上皮內(nèi)的免疫因子構(gòu)成。SIgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，具有調(diào)理、凝集以及沉淀抗原等重要作用[18]。IL-10是一種細(xì)胞因子抑制合成抑制因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)也是一種抗炎性細(xì)胞因子[19]。TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞驗(yàn)證因子，具有激活上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子，促使中性粒細(xì)胞聚集，增強(qiáng)其纖溶酶活性和吞噬作用，加速腸黏膜損傷[20]。郭明[21]研究發(fā)現(xiàn)，合生素和天蠶素抗菌肽兩者聯(lián)合使用可以顯著提高血液中免疫球蛋白A含量。同樣在本試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽可顯著提高回腸IgG含量，提示機(jī)體免疫力增強(qiáng)。飼糧中聯(lián)合添加牛至精油和抗菌肽也顯著提高肉兔空腸IL-10含量，對(duì)回腸IL-10含量影響不顯著，表明提高了肉兔機(jī)體的抗炎能力。對(duì)TNF-α進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合添加牛至精油及抗菌肽降低空腸中炎癥因子TNF-α的含量，減輕了其對(duì)腸黏膜的損傷。綜合來(lái)看，在飼糧中聯(lián)合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽對(duì)生長(zhǎng)肉兔腸道免疫具有促進(jìn)作用，提高了肉兔機(jī)體免疫力。

4 結(jié) 論

在飼糧中聯(lián)合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽提高了肉兔的平均日增重，降低了肉兔的料重比和腹瀉率，提高了腸道的機(jī)械屏障和免疫屏障，提高了機(jī)體免疫力。