王麗華 徐宏建 張全宇 張城瑞 馮冠智 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，犢牛光照時(shí)間縮短，自身合成維生素D的含量減少，同時(shí)母畜長(zhǎng)期采食未經(jīng)陽(yáng)光照射或日照過(guò)長(zhǎng)的飼草，植物中的麥角固醇無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D2供機(jī)體利用，以及規(guī)?；哪翀?chǎng)使母畜光照時(shí)間縮短，無(wú)法通過(guò)紫外線照射將皮膚的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3，使機(jī)體內(nèi)沒(méi)有足量的維生素D供乳汁合成，導(dǎo)致乳汁中維生素D的含量不足[1]。光照減少及乳汁中維生素D不足極易導(dǎo)致?tīng)倥Ｈ狈S生素D，鈣磷失衡，進(jìn)而引起軟骨病、佝僂病及骨變形等疾病[2]，且斷奶前犢牛處于快速生長(zhǎng)發(fā)育階段，對(duì)維生素D的要求更高，牛奶中的維生素D很難滿足犢牛最佳生長(zhǎng)和骨骼鈣化需求，因此犢牛需要進(jìn)行外源維生素D的補(bǔ)充。25羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25(OH)VD3]作為新型添加劑，直接在腎臟中羥化成活性形式1,25-二羥基維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2VD3]被機(jī)體利用[3-4]。飼喂25(OH)VD3不僅縮短了維生素D在肝臟中的一步羥化[5]，且擁有較長(zhǎng)的半衰期，能較穩(wěn)定的存在于機(jī)體內(nèi)[6]。與維生素D3相比，25(OH)VD3在鈣磷吸收、骨骼發(fā)育和免疫等方面擁有更高的生物效價(jià)[6]。已有報(bào)道稱新生犢牛迅速實(shí)現(xiàn)維生素D充足需補(bǔ)充6 000～10 000 IU/kg維生素D3，同時(shí)代乳品中補(bǔ)充300 mg/kg 25(OH)VD3和1.2 mg/kg維生素D3可以改善犢牛生長(zhǎng)性能及健康狀況[7-8]。25(OH)VD3擁有比維生素D3更高的吸收效率和代謝活性[9]，飼糧中添加25(OH)VD3可以降低斷奶仔豬炎癥因子水平，減少腹瀉，提高流行性腹瀉抗病力[10-11]；同時(shí)可以避免腸道損傷以及肝臟、腎臟功能障礙[12]。25(OH)VD3可以促進(jìn)骨骼發(fā)育，促進(jìn)鈣磷吸收，具有抗炎、抗氧化等功能，能更好地反映機(jī)體健康狀況。

到目前為止，有關(guān)25(OH)VD3的研究雖然很多，但是對(duì)斷奶前犢牛的研究鮮有報(bào)道，尚不清楚添加25(OH)VD3是否會(huì)對(duì)斷奶前犢牛產(chǎn)生影響。因此，本試驗(yàn)旨在研究添加不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血漿代謝物及糞便菌群的影響，初步探討新型添加劑應(yīng)用于斷奶前犢牛的可行性，以期為其合理應(yīng)用于犢牛生產(chǎn)中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、動(dòng)物與飼養(yǎng)

所有動(dòng)物試驗(yàn)操作均按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的原則和操作指南進(jìn)行(編號(hào)：NEAU-[2011]-9)。本試驗(yàn)在哈爾濱松花江奶牛場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)選取18頭體重相近、健康狀況良好的荷斯坦新生犢牛，體重(40.68±1.21) kg，試驗(yàn)期56 d。犢牛出生后2 h內(nèi)飼喂4 L初乳，12 h內(nèi)再飼喂2 L初乳。將犢牛隨機(jī)分為3組，每組6頭。對(duì)照組不添加25(OH)VD3，低劑量組每頭犢牛每天添加6 000 IU 25(OH)VD3，高劑量組每頭犢牛每天添加12 000 IU 25(OH)VD3。25(OH)VD3由山東某生物工程有限公司提供，25(OH)VD3含量20 000 IU/g。飼喂時(shí)添加到牛奶中并用奶桶飼喂。牛奶(干物質(zhì)含量13.55%，乳脂含量4.80%，乳蛋白含量3.44%)在飼喂前巴氏殺菌器殺菌。犢牛從開(kāi)始到第56天，每天07:00、12:00和18:00飼喂3次，共6 L。開(kāi)食料在1周之后開(kāi)始提供，所有犢牛在整個(gè)試驗(yàn)期均在1.4 m×2.0 m的單欄中飼喂，可自由飲水和采食，且至少有10%的開(kāi)食料剩余。開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (DM basis) %

1.2 生長(zhǎng)性能測(cè)定

記錄每天開(kāi)食料采食量。第28和56天對(duì)犢牛進(jìn)行稱重及體尺(體高、胸圍和腹圍)測(cè)量，計(jì)算平均日增重。每天觀察犢牛健康狀況，喂奶前觀察犢牛糞便狀態(tài)，對(duì)糞便進(jìn)行評(píng)分(0=正常；1=半成型、糊狀的；2=稀薄、但停留在墊草上；3=稀薄如水、滲透墊料)。當(dāng)糞便評(píng)分≥2時(shí)提供治療，直到腹瀉停止。每天測(cè)定直腸溫度判定發(fā)燒與否，大于39.5 ℃被判定為發(fā)燒。

1.3 飼料、糞便樣品采集與測(cè)定

對(duì)飼料樣品進(jìn)行每周取樣，最終混合成飼料樣品分析其營(yíng)養(yǎng)成分，于試驗(yàn)期第26、27、28、54、55和56天，通過(guò)直腸采糞法，連續(xù)3 d每隔6 h采集1次糞樣，并將糞便縮合成2份，其中一份以每100 g添加5 mL 10%的稀硫酸進(jìn)行固氮，另一份不作處理，將2份糞樣冷凍保存直至分析營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。飼料和糞樣55 ℃烘48 h，回潮24 h，粉碎過(guò)40目篩。按AOAC(2000)[13]方法進(jìn)行樣品干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量分析。根據(jù)Van Soest等[14]方法用耐熱α-淀粉酶測(cè)定中性洗滌纖維含量。參照AOAC(2000)[13]，采用電感耦合等離子質(zhì)譜法測(cè)定樣品的鈣和磷含量。參照GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》方法，以鹽酸不溶灰分(AIA)為內(nèi)標(biāo)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。其中飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量包括開(kāi)食料和牛奶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。于試驗(yàn)期第56天通過(guò)直腸采糞法采集糞便分裝在凍存管，-80 ℃保存。

1.4 血液樣品采集與分析

在試驗(yàn)第1、28和56天晨飼后3 h于犢牛頸靜脈采血，并用負(fù)壓肝素鈉管收集血液，1 960×g離心15 min，將分離的血漿分裝于1.5 mL清潔的離心管中，-20 ℃保存，待測(cè)。血漿葡萄糖、總蛋白、膽固醇含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性由北京華英生物技術(shù)研究所協(xié)助檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司，測(cè)定儀器型號(hào)為邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。采用原子吸收法測(cè)定血漿鈣和鎂含量，采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定血漿磷含量；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血漿白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量(北京華英生物技術(shù)研究所)，測(cè)定儀器型號(hào)為華衛(wèi)德朗DR-200BS(無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)。血漿25(OH)VD3含量使用將來(lái)生物有限公司牛25(OH)VD3ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 糞便細(xì)菌群落組成分析

將保存的糞樣送到北京百邁客生物科技有限公司，利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定細(xì)菌群落組成。提取糞便中的總DNA，提取的DNA進(jìn)行3次高效高保真的PCR擴(kuò)增，利用引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域，引物序列為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，使用酶標(biāo)儀和熒光試劑對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，按物質(zhì)的量比例混合后在Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

生長(zhǎng)性能、健康狀況、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血漿指標(biāo)采用SAS 9.4的PROC MIXED模型進(jìn)行分析，牛作為隨機(jī)效應(yīng)，處理、時(shí)間、處理×?xí)r間作為固定效應(yīng)，初始的生長(zhǎng)性能和血漿指標(biāo)作為協(xié)變量加入模型。糞便菌群指標(biāo)采用SAS 9.4的GLM模型進(jìn)行分析。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。P≤0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛生長(zhǎng)性能及健康狀況的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組體重和平均日增重顯著提高(P<0.05)，而低劑量組和高劑量組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組和低劑量組相比，高劑量組體高顯著提高(P<0.05)，而低劑量組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組糞便評(píng)分顯著降低(P<0.05)，而低劑量組和高劑量組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間開(kāi)食料采食量、胸圍、腹圍和直腸溫度在均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛生長(zhǎng)性能及健康狀況的影響Table 2 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on growth performance and health status of pre-weaning calves

2.2 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組干物質(zhì)表觀消化率顯著提高(P<0.05)，且低劑量組和高劑量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高劑量組中性洗滌纖維(P=0.05)和鈣表觀消化率(P<0.05)顯著提高，而低劑量組差異不顯著(P>0.05)。各組之間粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、酸性洗滌纖維和磷表觀消化率差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table 3 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on nutrient apparent digestibility of pre-weaning calves %

2.3 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛血漿25(OH)VD3、鈣、磷、鎂含量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組血漿25(OH)VD3含量顯著提高(P<0.05)，且高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組血漿鈣含量顯著提高(P<0.05)，且低劑量組和高劑量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高劑量組血漿磷含量顯著提高(P<0.05)，而低劑量組差異不顯著(P>0.05)。各組之間血漿鎂含量差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛血漿25(OH)VD3、鈣、磷、鎂含量的影響Table 4 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on contents of 25(OH)VD3, calcium, phosphorus and magnesium in plasma of pre-weaning calves

2.4 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛血漿生化指標(biāo)和細(xì)胞因子含量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組血漿堿性磷酸酶活性存在降低趨勢(shì)(P=0.06)，低劑量組和高劑量組血漿白細(xì)胞介素-2含量顯著降低(P<0.05)。

表5 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛血漿生化指標(biāo)和細(xì)胞因子含量的影響Table 5 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on plasma biochemical indexes and cytokine contents of pre-weaning calves

2.5 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛糞便菌群的影響

由表6可知，在犢牛糞便菌群科水平，與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組糞便中毛螺菌科和普雷沃式菌科相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，低劑量組和高劑量組糞便中鼠桿菌科、克里斯滕森菌科、螺旋體科和未培養(yǎng)_細(xì)菌_o_柔膜菌綱_RF39(uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

表6 不同劑量25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛糞便菌群相對(duì)豐度的影響Table 6 Effects of different doses of 25(OH)VD3 on fecal microflora relative abundances of pre-weaning calves

3 討 論

盡管25(OH)VD3對(duì)斷奶前犢牛的研究鮮有報(bào)道，但已有研究表明飼糧添加25(OH)VD3可以提高斷奶犢牛平均日增重[8]。Fritts等[15]研究表明，母豬飼糧添加維生素D3或25(OH)VD3可以提高斷奶仔豬的平均日增重。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，飼糧添加25(OH)VD3可以提高犢牛平均日增重和體重，且高劑量組體高顯著高于對(duì)照組和低劑量組。原因與上述相似，即犢牛飼喂25(OH)VD3可以增加體內(nèi)25(OH)VD3轉(zhuǎn)化為活性1,25(OH)2VD3，促進(jìn)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生[16]，增加血液中鈣的吸收，進(jìn)而促進(jìn)骨骼發(fā)育，有助于犢牛平均日增重和體重的增加。研究表明，飼糧添加25(OH)VD3可以降低軟骨發(fā)育不良及嚴(yán)重程度[5,17]，然而，Celi等[18]研究表明，25(OH)VD3對(duì)生長(zhǎng)牛的體尺指標(biāo)無(wú)顯著影響。這與本研究結(jié)果不同，造成這種差異的原因可能是由于添加劑量與飼喂時(shí)期的不同，新生犢牛正處于快速生長(zhǎng)階段，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力較強(qiáng)。此外，腹瀉是所有幼小動(dòng)物極易發(fā)生的腸道疾病，影響動(dòng)物健康狀態(tài)。Nonnecke等[19]研究結(jié)果顯示感染病毒性腹瀉的牛血清中25(OH)VD3含量降低了51%。而Yang等[10]的研究結(jié)果表明，飼糧添加25(OH)VD3可以降低仔豬流行性腹瀉病毒感染。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示飼糧添加25(OH)VD3降低了犢牛糞便評(píng)分，減少腹瀉。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率直接反映動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用。Duffy等[20]研究表明，飼糧添加25(OH)VD3可以提高育肥豬飼料中鈣表觀消化率。Adhikari等[21]研究表明，額外補(bǔ)充無(wú)論何種形式的維生素D都可以提高蛋雞鈣表觀總消化道消化率。這與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致，飼糧添加25(OH)VD3提高了鈣表觀消化率，此外本試驗(yàn)還得出飼糧添加25(OH)VD3提高了中性洗滌纖維和干物質(zhì)表觀消化率，原因可能是由于犢牛腹瀉發(fā)生降低，健康狀況得到改善，使瘤胃發(fā)育較好，瘤胃微生物及腸道微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收增強(qiáng)。

血漿25(OH)VD3含量是衡量機(jī)體維生素D狀態(tài)的重要指標(biāo)。目前由NRC(2001)標(biāo)準(zhǔn)推薦的維生素D3要求的最低水平為300 IU/d，這是預(yù)防犢牛佝僂病所必需的最低水平[22]。在允許的范圍內(nèi)提高飼糧維生素D的含量有助于機(jī)體對(duì)鈣磷吸收，維持健康和正常的生理功能。有研究表明，當(dāng)血漿25(OH)VD3含量達(dá)到200 ng/mL時(shí)，有毒性作用[23-24]。在允許范圍內(nèi)添加25(OH)VD3時(shí)，1,25(OH)2VD3的產(chǎn)量增加，從而調(diào)節(jié)鈣磷動(dòng)態(tài)平衡的能力。有研究結(jié)果表明，飼糧添加25(OH)VD3可以提高泌乳牛血漿鈣、磷和25(OH)VD3含量[25]。大量添加25(OH)VD3能提高血漿25(OH)VD3含量[26-27]。Duffy等[20]的研究結(jié)果顯示，飼糧添加25(OH)VD3顯著提高了犢牛血漿25(OH)VD3含量。本試驗(yàn)所得結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，即飼糧添加25(OH)VD3可有效提高斷奶前犢牛血漿鈣、磷和25(OH)VD3含量。這是由于25(OH)VD3的添加使進(jìn)入血液中25(OH)VD3含量增加，同時(shí)使腎臟中進(jìn)一步羥化成活性形式的1,25(OH)2VD3含量增加，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)鈣、磷的吸收，從而使血漿中鈣、磷含量增加。這也是骨骼發(fā)育加快，從而增加平均日增重和體重的原因。

堿性磷酸酶廣泛存在于肝臟、骨骼、腎臟等組織中，隨著犢牛快速生長(zhǎng)伴隨的骨質(zhì)破壞和再生，會(huì)使大量的堿性磷酸酶釋放進(jìn)入血液。有研究表明，1,25(OH)2VD3可以提高骨源性細(xì)胞中堿性磷酸酶活性[28]，這與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致。可能原因是飼糧添加25(OH)VD3后1,25(OH)2VD3活性形式增加，進(jìn)而促進(jìn)堿性磷酸酶活性增加。堿性磷酸酶活性的強(qiáng)弱可反映動(dòng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)性能，提高血液中堿性磷酸酶的活性，有利于提高動(dòng)物的平均日增重，參與細(xì)胞中的物質(zhì)代謝，使?fàn)倥５姆翘禺愋悦庖吖δ茉鰪?qiáng)。黃偉等[29]研究表明，血清25(OH)VD3含量與白細(xì)胞介素-2含量呈負(fù)相關(guān)，急性腹瀉患兒補(bǔ)充維生素D可以抑制炎癥細(xì)胞因子。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)飼糧添加25(OH)VD3可以降低血漿白細(xì)胞介素-2含量，與Müller等[30]的研究結(jié)果一致。可能是由于產(chǎn)生的1,25(OH)2VD3特異性受體介導(dǎo)，使血漿白細(xì)胞介素-2的含量降低。

瘤胃球菌科、毛螺菌科、理研菌科以及普雷沃式菌科作為有益菌，因其嚴(yán)格厭氧在犢牛腸道中占主導(dǎo)地位[31-32]?？死锼闺婆cuncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39作為厚壁菌門細(xì)菌，雖然顯著降低，但是相對(duì)豐度占比小。鼠桿菌科和螺旋體科均作為有害菌存在于犢牛的腸道中，極易使?fàn)倥Ｖ虏?、腹瀉，甚至死亡。鼠桿菌科作為導(dǎo)致腹瀉的有害菌在對(duì)照組中相對(duì)豐度達(dá)12.75%，較高的相對(duì)豐度使對(duì)照組犢牛腹瀉狀況較添加25(OH)VD3組嚴(yán)重，糞便評(píng)分相對(duì)較高。飼糧添加25(OH)VD3后致病菌的相對(duì)豐度均有所降低，這說(shuō)明飼糧添加25(OH)VD3可以提高犢牛健康狀況，降低腹瀉，這也印證了飼糧添加25(OH)VD3后犢牛糞便評(píng)分降低。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加25(OH)VD3能夠提高斷奶前犢牛平均日增重、體重和體高；促進(jìn)犢牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率；提高犢牛血漿鈣、磷和25(OH)VD3含量；改善犢牛糞便菌群，降低腹瀉。

② 本試驗(yàn)條件下，飼糧添加高劑量(每頭犢牛每天12 000 IU)25(OH)VD3更有利于維持?jǐn)嗄糖盃倥＝】担龠M(jìn)生長(zhǎng)。