馮冠智 徐宏建 王麗華 張城瑞 祖智富 張永根*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436)

目前許多種公牛站存在著種公牛繁殖性能減弱、精液質(zhì)量差的問(wèn)題，這直接關(guān)系到種公牛站的生存與發(fā)展。研究表明，影響種公牛繁殖性能和精液質(zhì)量的因素有很多，包括環(huán)境因素，如溫度和光照[1]；公牛的生理狀態(tài)，如品種和年齡[2]以及公牛的飼養(yǎng)管理[3]。然而現(xiàn)在規(guī)?；⒓s化程度的大幅提高，環(huán)境條件和生理狀態(tài)相對(duì)一致，所以種公牛營(yíng)養(yǎng)的供給將直接影響其繁殖潛力和精液質(zhì)量。

維生素D3本身不具有活性，它可以先被細(xì)胞色素酶(CYP2R1)轉(zhuǎn)化為25羥基維生素D3(25VD3)，然后被CYP27B1轉(zhuǎn)化為活性形式的1,25二羥基維生素D3[4-5]。維生素D的作用機(jī)制是1,25二羥基維生素D3激活靶組織內(nèi)的維生素D受體，從而發(fā)揮維生素D3的大部分生理作用。睪丸、生殖細(xì)胞和雄性生殖道上皮細(xì)胞也存在維生素D受體和CYP27B1，這表明維生素D在精子形成和成熟以及性激素分泌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能有助于提高種公牛繁殖功能[6]。研究表明，飼喂高劑量維生素D3可提高血清25VD3含量，改善精子質(zhì)量、激素合成、精漿成分[7]。25VD3是維生素D3轉(zhuǎn)化為最終活性形式1,25二羥基維生素D3的中間代謝物產(chǎn)物，它的半衰期比1,25二羥基維生素D3長(zhǎng)，并且有研究表明，牛[8]、禽[9]和豬[10]對(duì)25VD3的吸收效率和體內(nèi)代謝活性均高于維生素D3，因而成為研究熱點(diǎn)。

維生素D3被認(rèn)為與種公牛的繁殖能力有關(guān)，但有關(guān)25VD3對(duì)不同生理階段荷斯坦種公牛凍精品質(zhì)和健康影響的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究目的是評(píng)價(jià)25VD3替代維生素D3對(duì)不同階段種公牛的凍精品質(zhì)、精漿抗氧化能力、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率以及鈣、磷、鎂代謝的影響，旨在為高效利用25VD3提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有動(dòng)物試驗(yàn)操作均按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的原則和操作指南進(jìn)行(編號(hào)：NEAU-[2011]-9)。本試驗(yàn)在上海奶牛育種中心進(jìn)行。試驗(yàn)選取32頭荷斯坦種公牛(16頭為平均30月齡和16頭為平均12月齡)，根據(jù)體重、年齡和精子活力隨機(jī)分組。試驗(yàn)預(yù)試期14 d，正試期60 d。公牛被拴系在單獨(dú)的圍欄里，圍欄上配有自動(dòng)飲水器。每天07:00和13:30飼喂2次，自由采食。每天調(diào)整給料量，以達(dá)到至少5%的剩料量。荷斯坦種公牛試驗(yàn)飼糧，參照中國(guó)《奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 34—2004)[11]中種公牛營(yíng)養(yǎng)需要配制而成，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示，精料由光明牧業(yè)有限公司配制。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

本試驗(yàn)為完全隨機(jī)區(qū)組2×2雙因素(不同形式維生素D3和不同階段種公牛)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，不同形式維生素D3分別為25VD3和維生素D3，不同階段種公牛分別為16頭平均30月齡成年荷斯坦種公牛和16頭平均12月齡青年荷斯坦種公牛，共分為4個(gè)組：成年牛維生素D3組(300 IU/kg)、成年牛25VD3組(300 IU/kg)、青年牛維生素D3組(300 IU/kg)、青年牛25VD3組(300 IU/kg)。25VD3由某生物工程有限公司提供(產(chǎn)品含量為20 000 IU/g)

1.2 采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定

記錄正試期的上料量及剩料量并算出采食量，每周收集飼料樣品，并在研究結(jié)束時(shí)將其集合成每月1批進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析。于試驗(yàn)期第58、59和60天進(jìn)行代謝試驗(yàn)，連續(xù)3 d每隔6 h收集1次新鮮糞樣，收集的糞樣縮合至500 g 2份，其中每100 g添加5 mL 10%稀硫酸固氮后冷凍保存，另一份直接冷凍保存直至分析。飼料和糞樣55 ℃烘干48 h，回潮24 h，粉碎過(guò)40目篩。樣品的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量按AOAC(2000)[12]方法進(jìn)行分析。根據(jù)Van Soest等[13]方法測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。根據(jù)AOAC(2000)[12]方法，采用電感耦合等離子質(zhì)譜法測(cè)定樣品的鈣、磷和鎂含量。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率以鹽酸不溶灰分(AIA)為指示劑，參照GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》[14]方法測(cè)定AIA含量。采用內(nèi)源指示劑法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物表觀質(zhì)消化率，計(jì)算公式如下：

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[(飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/飼糧中AIA含量-糞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/糞中AIA含量)/飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量/飼糧中AIA含量)]×100。

1.3 尿液樣品的采集與分析

于試驗(yàn)期第58、59和60天進(jìn)行尿液樣品的采集，連續(xù)3 d每隔6 h用收集容器收集1次尿液，尿樣中會(huì)有雜質(zhì)，用粗紗布過(guò)濾后放入干燥潔凈的50 mL試管中。

按照Martinez等[15]采用原子吸收方法測(cè)定尿樣中總鈣和總鎂含量。尿樣總磷含量采用鉬藍(lán)法[16]測(cè)定。

糞中礦物質(zhì)排放(g/d)=礦物質(zhì)攝入量(g/d)-[礦物質(zhì)攝入量(g/d)×礦物質(zhì)消化率(%)]；尿中礦物質(zhì)排放(g/d)=尿量(L/d)×尿中礦物質(zhì)含量(g/L)；礦物質(zhì)沉積量(g/d)=礦物質(zhì)攝入量(g/d)-尿中礦物質(zhì)排放(g/d)-糞中礦物質(zhì)排放(g/d)。

1.4 精子的低溫保存及凍精參數(shù)評(píng)價(jià)

于試驗(yàn)期第1、30和60天08:30用預(yù)熱過(guò)的人工陰道采集精液。在37 ℃使用三羥甲基氨基甲烷稀釋液將精液逐漸稀釋?zhuān)♂尯蟮木簶悠吩? ℃冷柜冷藏2 h。使用自動(dòng)裝填機(jī)將精液自動(dòng)裝填至0.25 mL吸管中。然后將吸管在7 min內(nèi)程序冷凍至-140 ℃，在液氮蒸汽中懸浮10 min，然后浸入-196 ℃液氮中保存。冷凍保存的精液在37 ℃水浴中解凍30 s。然后將解凍的精液轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過(guò)的試管中，在37 ℃的水浴中孵育2 h，并且用伊紅-黑素染色法觀察精子的活力和異常情況[17]。玻片用精液、伊紅和黑精混合染色法涂片，對(duì)載玻片中200個(gè)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，分為未染色的活精子和完全或部分染色的死精子。載玻片進(jìn)一步檢查精子異常：頭部異常、尾部異常、中段異常、頭部脫落、尾部盤(pán)繞、存在細(xì)胞質(zhì)液滴。按照Chinoy等[18]用硝酸銀染色法評(píng)價(jià)精子頂體完整性。按照Revell等[19]采用低滲透腫脹試驗(yàn)評(píng)估精子質(zhì)膜完整性。收集解凍后的精液，1 500 r/min分離15 min，然后收集精漿，精漿總抗氧化能力、丙二醛含量及過(guò)氧化氫酶和還原型谷胱甘肽活性使用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4雙因素混合模型程序進(jìn)行分析。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。當(dāng)P≤0.05時(shí)為差異顯著，當(dāng)0.05

2 結(jié) 果

2.1 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精品質(zhì)的影響

由表2可知，飼喂25VD3比飼喂維生素D3顯著提高了種公牛精子活力和膜完整性(P<0.05)，有增加精子存活率的趨勢(shì)(P=0.08)。成年種公牛解凍后精子活力(P<0.05)和存活率(P<0.01)均高于青年種公牛。

表2 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different forms of vitamin D3 on frozen semen quality in Holstein breeding bulls at different stages %

2.2 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精抗氧化能力的影響

由表3可知，添加25VD3有降低種公牛解凍精液中丙二醛含量的趨勢(shì)(P=0.07)。成年種公牛解凍后精子過(guò)氧化氫酶活性顯著高于青年種公牛(P<0.05)。

表3 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精抗氧化能力的影響Table 3 Effects of different forms of vitamin D3 on antioxidant capacity of frozen semen in Holstein breeding bulls at different stages

2.3 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛干物質(zhì)采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表4可知，飼喂不同形式維生素D3的種公牛干物質(zhì)采食量無(wú)顯著差異(P>0.05)。不同生長(zhǎng)階段種公牛添加25VD3和維生素D3組的干物質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維、磷和鎂的表觀消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。但25VD3組種公牛鈣表觀消化率顯著提高(P<0.05)，粗蛋白質(zhì)表觀消化率存在升高的趨勢(shì)(P=0.09)。

表4 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛干物質(zhì)采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table 4 Effects of different forms of vitamin D3 on DMI and nutrient apparent digestibility of Holstein breeding bulls at different stages

續(xù)表4項(xiàng)目Items成年種公牛 Adult breeding bull維生素D3Vitamin D325羥基維生素D3 25VD3青年種公牛 Young breeding bull維生素D3Vitamin D325羥基維生素D3 25VD3SEMP值 P-value階段Stage形式Form交互作用Interaction營(yíng)養(yǎng)物表觀質(zhì)消化率 Nutrient apparent digestibility/%干物質(zhì) DM67.5268.9366.7566.780.870.090.420.40粗蛋白質(zhì) CP61.9263.9459.3262.371.250.050.090.92粗脂肪 EE55.1558.8152.4653.641.540.010.110.42中性洗滌纖維 NDF48.5352.6749.8950.711.720.410.180.11鈣 Ca44.1945.3242.3246.020.890.520.010.16磷 P45.6145.3441.5144.081.290.050.380.28鎂 Mg44.0545.6345.7446.310.690.100.130.46

2.4 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛鈣、磷、鎂代謝的影響

由表5可知，飼喂25VD3的種公牛尿磷和尿鎂排出量顯著低于飼喂維生素D3的公牛(P<0.05)。成年種公牛鈣、磷、鎂的攝入量、沉積量和糞排出量以及尿磷排出量極顯著高于青年種公牛(P<0.01)。

表5 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛礦物質(zhì)代謝的影響Table 5 Effects of different forms of vitamin D3 on mineral metabolism of Holstein breeding bulls at different stages g/d

3 討 論

3.1 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精品質(zhì)的影響

1,25二羥基維生素D3是維生素D3的主要代謝產(chǎn)物，是一種具有生物活性的類(lèi)固醇激素，是維生素D的最高活性狀態(tài)，主要是與細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體(VDR)結(jié)合，引起精子細(xì)胞內(nèi)鈣含量的升高，從而提高精子活力和介導(dǎo)精子的頂體反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[20]。25VD3組有更高的精子活力，這是由于1,25二羥基維生素D3與VDR結(jié)合后，通過(guò)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1編碼基因(ABCA1)介導(dǎo)膽固醇從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，使蛋白磷酸化，從而提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，增加了脂肪酶活性，消耗了甘油三酯，加快精子運(yùn)動(dòng)，從而增加精子活力[21]；也可能是補(bǔ)充25VD3增加了精子頸部和頭部的鈣含量，有助于提高精子活力[22]。精子膜完整性對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)高度敏感，氧化自由基積累和抗氧化能力受損導(dǎo)致膜完整性降低以及精子DNA受損，因此精子膜完整率的升高歸因于精漿抗氧化能力的增強(qiáng)。這與Lin等[23]研究相似，添加維生素D3有可能改善種公豬的精子質(zhì)量和膜完整性。Blomberg Jensen等[24]和Mahmoudi等[25]研究表明，所有調(diào)節(jié)維生素D活性的成分，如VDR、24-羥基化酶(CYP24A1)和1α羥化酶(CYP27B1)，在睪丸、附睪、精囊、前列腺和精子中都有表達(dá)，這表明維生素D對(duì)精子的發(fā)生和成熟非常重要。董洪俊[26]研究表明，飼糧添加25VD3顯著增加了CYP24A1基因的表達(dá)，而在公豬上CYP24A1的高表達(dá)與精液品質(zhì)呈正相關(guān)性，能夠提高精子活力、正常精子百分比和精子膜的完整性。成年種公牛解凍精液的精子活力和精子存活率均高于青年種公牛，這是由于精液品質(zhì)與種公牛達(dá)到體成熟時(shí)間有關(guān)，體成熟以前雖然可以進(jìn)行采精，但生殖系統(tǒng)的功能還不是很完善，產(chǎn)精量較少、活力和存活率較低，而且性欲和交配能力較差[27]。

3.2 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛凍精抗氧化能力的影響

丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，可以引起黏膜損傷并激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促使巨噬細(xì)胞釋放出大量炎癥介質(zhì)，而精子內(nèi)丙二醛的含量可反映膜脂過(guò)氧化損傷的程度。丙二醛含量過(guò)高會(huì)增加膜脂過(guò)氧化損傷，健康精液的丙二醛含量顯著低于不孕癥精液。本研究中飼喂25VD3有降低解凍精漿中丙二醛含量的趨勢(shì)，與Yang等[28]研究結(jié)果相似，飼糧中添加25VD3可提高斷奶仔豬谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性并且降低丙二醛含量。成年種公牛凍精中過(guò)氧化氫酶活性高于青年種公牛，過(guò)氧化氫酶是一種抗氧化酶，它能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫轉(zhuǎn)換成水和氧氣，阻止氧化反應(yīng)從而保護(hù)精子[29]。飼喂25VD3對(duì)超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽含量無(wú)顯著影響，這與彭巍等[30]試驗(yàn)結(jié)果不同，這可能由于精液冷凍保存過(guò)程中產(chǎn)生了活性氧自由基造成了精子氧化損傷。

3.3 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛干物質(zhì)采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

李曉彤等[31]試驗(yàn)報(bào)道，反芻動(dòng)物血鈣含量直接影響瘤胃平滑肌收縮程度。圍產(chǎn)期低血鈣癥嚴(yán)重影響奶牛胃腸道平滑肌收縮從而降低干物質(zhì)采食量。盡管本試驗(yàn)補(bǔ)充25VD3的青年種公牛干物質(zhì)采食量稍有增加，但未發(fā)現(xiàn)不同形式維生素D3對(duì)干物質(zhì)采食量的顯著影響?？赡苁怯捎谘}含量降低到一定閾值以下才會(huì)顯著影響干物質(zhì)采食量。飼喂25VD3可改善蛋白質(zhì)和鈣表觀消化率。這與張帆等[32]研究結(jié)果相似，維生素D3在奶牛鈣、磷代謝的過(guò)程中起著重要的作用，能夠促進(jìn)鈣鹽在骨中的沉積和鈣化。馮冠智等[8]也報(bào)道了，飼糧中添加25VD3可顯著提高種公牛血清中鈣、磷含量。維生素D缺乏癥常見(jiàn)的影響是腸道對(duì)鈣和磷的吸收不良，飼糧中補(bǔ)充25VD3可提高血液循環(huán)中的鈣離子含量，從而增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，從而促進(jìn)了鈣的吸收與利用。

3.4 不同形式維生素D3對(duì)不同階段荷斯坦種公牛鈣、磷、鎂代謝的影響

飼喂25VD3可增強(qiáng)腎小管對(duì)磷和鎂的重吸收作用。這是由于25VD3的增加轉(zhuǎn)化為更多的1,25二羥基維生素D3，它在腎小管中可抑制1α羥化酶活性，激活24羥化酶，協(xié)同甲狀旁腺素對(duì)鈣的重吸收作用，促進(jìn)鈣結(jié)合蛋白、鈣泵等介導(dǎo)的跨上皮鈣轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。由于鎂離子和鈣離子同為2價(jià)陽(yáng)離子，可推測(cè)影響鎂的重吸收作用的機(jī)制可能與鈣的作用方式相近。飼喂25VD3可增加對(duì)飼糧中磷和鎂的重吸收從而降低生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染。因此飼糧中添加25VD3是提高鈣、磷吸收效率維持機(jī)體礦物質(zhì)平衡的有效方式。成年種公牛的鈣、磷、鎂的攝入量、沉積量和糞排出量以及尿磷排出量高于青年種公牛，這與初漢平[34]研究結(jié)果相反，軟組織和骨骼發(fā)育活躍期的青年奶牛的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致鈣、磷的需要量增加，而隨著動(dòng)物軟組織和骨骼的成熟，鈣、磷的需要量會(huì)減少。本試驗(yàn)可能是由于種公牛的鈣、磷、鎂需要量與個(gè)體體重有關(guān)，而成年種公牛由于高體重所以需要攝入更多的鈣、磷、鎂才能維持自身機(jī)體的正常，這也間接導(dǎo)致了尿液和糞便的鈣、磷、鎂排放量增加。

4 結(jié) 論

與同等水平維生素D3相比，飼糧中添加25VD3能增加成年種公牛解凍精液的精子活力、膜的完整性，從而改善了精液質(zhì)量，提高鈣表觀消化率以及增加對(duì)飼糧中磷、鎂的重吸收作用，降低尿液磷、鎂的排放量，從而降低生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染。