侯路釗 王增林 孫雪麗 劉桃桃 李秋鳳 曹玉鳳 李建國 高艷霞 陳攀亮

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001)

反芻動物甲烷(CH4)排放與全球氣候變暖和飼料能損失密切相關(guān)。甲烷能損失占飼料總能的2%～12%[1]。研究表明，反芻動物甲烷排放量占全球甲烷排放量的15%[2]。除此之外，畜牧業(yè)產(chǎn)生的甲烷是人為排放甲烷的重要來源之一，占全球人類活動甲烷排放量的28%[3]。因此，減少反芻動物的甲烷排放量對提高飼糧能量利用率和保護(hù)環(huán)境有重要作用。

反芻動物甲烷主要通過瘤胃產(chǎn)甲烷菌經(jīng)二氧化碳(CO2)/氫氣(H2)還原途徑生成[4]。產(chǎn)甲烷菌屬于瘤胃古菌，可利用多種降解底物生成甲烷。瘤胃產(chǎn)甲烷菌受多種因素的影響，其中飼糧組成對產(chǎn)甲烷菌影響較大[5-6]。研究表明，高纖維飼糧可促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的增殖，并提高反芻動物甲烷日排放量[7]。與高纖維飼糧比，高淀粉飼糧可降低產(chǎn)甲烷菌多樣性和甲烷菌代謝活性[8]。此外，研究表明飼糧非纖維性碳水化合物(NFC)/中性洗滌纖維(NDF)比值對甲烷排放量有顯著影響[9]，隨著飼糧NDF/NFC比值的降低，甲烷日排放量逐漸降低。這可能是低NDF/NFC比值的飼糧改變了瘤胃發(fā)酵模式，提高了丙酸利用菌與產(chǎn)甲烷菌競爭氫的能力，減少了甲烷菌合成甲烷的底物含量，并降低了產(chǎn)甲烷菌的活性，從而抑制了甲烷的生成[10]。目前對反芻動物甲烷減排的研究主要集中在調(diào)整飼糧組成；但是，通過調(diào)控飼糧NDF/淀粉比值來減少荷斯坦公牛甲烷排放量的相關(guān)研究較少。因此，本試驗通過研究飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛瘤胃古菌和甲烷排放量的影響，確定飼糧NDF/淀粉比值與甲烷排放量的相關(guān)關(guān)系，旨在為反芻動物甲烷減排提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

飼養(yǎng)試驗于2018年2月初至2018年5月中旬在保定市宏達(dá)奶牛場完成。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因素完全隨機(jī)試驗設(shè)計，選擇36頭健康、膘情正常、體重[(282±37) kg]相近的荷斯坦公牛作為試驗牛，隨機(jī)分為3組，每組12頭，散欄飼養(yǎng)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組試驗牛分別飼喂NDF/淀粉比值為1.13、1.38、1.63的全混合日糧(TMR)。各組TMR能量水平相同，粗蛋白質(zhì)水平接近。預(yù)試期7 d，正試期90 d。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

續(xù)表1項目Items組別 GroupsⅠⅡⅢ磷 P0.310.380.38淀粉 Starch 29.1926.9925.02中性洗滌纖維/淀粉 NDF/starch1.131.381.63

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗牛每天飼喂2次TMR(07:00和17：00)，自由采食與飲水。每天打掃料槽，每周清洗水槽2～3次，保持水槽和料槽干凈、衛(wèi)生。

1.4 瘤胃液的采集與處理

于正試期第88天晨飼前用口腔導(dǎo)管通過真空泵抽取瘤胃液，每組采集8頭試驗牛的瘤胃液，將采集的瘤胃液用4層紗布進(jìn)行過濾后，裝于已滅菌的離心管，立即投入液氮中，送回實驗室后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 絕對定量PCR

1.5.1 總DNA的提取

瘤胃液總DNA的提取主要參考郭嫣秋等[15]、Qiao等[16]、李長青等[17]的方法，具體理論依據(jù)參考李長青等[17]、李萌等[18]。將樣品渦旋1 min，取200 μL瘤胃液樣品，按Solarbio通用基因組DNA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書提取瘤胃液總DNA。

1.5.2 總DNA的質(zhì)量檢測

使用Thermo NANo DROP 2000分光光度計檢測瘤胃液總DNA的吸光度(OD)260 nm/280 nm在1.77～1.95，DNA濃度在25.0～97.7 ng/μL，并于-20 ℃保存。

1.5.3 引物序列

試驗引物選用β-肌動蛋白(β-actin)[19]為內(nèi)參基因，目的基因為反芻獸甲烷短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)[15]，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，基因引物序列見表2。

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequences of genes

1.5.4 普通PCR

打開Eppendorp PCR儀預(yù)熱20 min，反應(yīng)體系和條件見表3。

表3 反應(yīng)體系和條件Table 3 Reaction system and conditions

1.5.5 瓊脂凝膠電泳

配制1%瓊脂糖凝膠[稱取0.2 g瓊脂糖加20 mL 0.5×硼酸(TBE)]放入帶蓋的瓶子中，置于微波爐中(調(diào)到中低檔，1～2 min)，待瓶身微熱加2 μL無毒核酸染料Super GelRed(產(chǎn)品貨號：S2001，Everbright Inc，美國)，倒膠，20～30 min后拔梳子，倒0.5×TBE，沒過膠面，加樣2 μL，電泳條件設(shè)為：120 V，100 mA。瓊脂凝膠電泳圖譜結(jié)果見圖1。

M：標(biāo)記物 marker；M.r：為反芻獸甲烷短桿菌 Methanobrevibacter ruminantium；β：β-肌動蛋白 β-actin。圖2同 the same as Fig.2。圖1 瓊脂凝膠電泳圖譜Fig.1 Agar gel electrophoretogram

1.5.6 膠回收

稱取0.25 g瓊脂糖加25 mL 0.5×TBE(1%瓊脂糖凝膠)放入帶蓋的瓶子中，置于微波爐中(調(diào)中低檔，1～2 min)，待瓶身微熱加2.5 μL無毒核酸染料Super GelRed，倒膠，20～30 min后拔梳子，倒0.5×TBE，沒過膠面，加樣20 μL，電泳條件設(shè)為：120 V，100 mA，切膠。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]回收做標(biāo)準(zhǔn)品，測其濃度在10～30 ng/μL，于-20 ℃保存。膠回收產(chǎn)物電泳圖譜結(jié)果見圖2。

圖2 膠回收產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Gel recovery product electrophoretogram

1.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(5 μL標(biāo)準(zhǔn)品加45 μL Easy dilution)后做8個梯度(目的基因：1.13×1013～1.13×107；內(nèi)參基因：5.74×1014～1.13×108)，每次加Easy dilution需渦旋3 min，離心30 s(保證混勻)，全部溶解后，做好標(biāo)記，于-20 ℃保存。使用Bio-Rad熒光定量PCR儀檢測樣品，反應(yīng)體系及條件見表4，選用6個點做標(biāo)準(zhǔn)曲線。熔解曲線有明顯高峰，出峰溫度在81 ℃，說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高。目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.543x+50.063(y是Ct值，x是log拷貝數(shù))，擴(kuò)增效率為91.5%，r2=99.6%；內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.029x+49.217(y是Ct值，x是log拷貝數(shù))，擴(kuò)增效率為113.0%，r2=98.4%。擴(kuò)增曲線見圖3，熔解曲線見圖4，目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖3 擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curve

圖4 熔解曲線Fig.4 Melting curve

圖5 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve line of target gene

圖6 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve line of reference gene

1.5.8 樣品測定

同一批次96孔板目的基因、內(nèi)參基因各設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線7個點、24個待測混池樣品、空白樣品各2個重復(fù)，待測樣品目的基因、內(nèi)參基因各3個重復(fù)，反應(yīng)體系及條件同表4。

表4 反應(yīng)體系及條件Table 4 Reaction system and conditions

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 瘤胃古菌多樣性測定

對古菌16S V9區(qū)進(jìn)行Illumina HiSeq測序，由北京諾禾致源科技有限公司代測。數(shù)據(jù)庫測定方法：參照Qiime V1.9.1軟件的Tags質(zhì)量控制流程對下機(jī)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾后為有效數(shù)據(jù)(clean data)。利用Uparse v7.0.1001軟件[20]以97%的一致性對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類，對具有OTUs代表序列使用Mothur方法與SILVA 132數(shù)據(jù)庫[21]進(jìn)行物種注釋。

1.6.2 樣品六氟化硫(SF6)和甲烷濃度的測定以及甲烷排放量的計算

甲烷濃度測定：每次測定樣品前應(yīng)先用2.74 mg/m3的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行校正。色譜條件：載氣為99.999%高純氮氣，燃?xì)鉃?9.999%高純H2，空氣為助燃?xì)?，柱溫?0 ℃，前進(jìn)樣口溫度為50 ℃，后進(jìn)樣口溫度為375 ℃，火焰離子化檢測器(FID)溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1 mL，空氣流速為400 mL/min，H2流速為30 mL/min，氮氣流速為25 mL/min，分流比為20∶1。SF6送北京中科院大氣物理研究所中國生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)大氣分中心代為檢測，SF6標(biāo)準(zhǔn)氣體濃度為1.99×10-4mg/m3。SF6測定試驗條件：載氣為氬氣(Ar)-甲烷(10%)，載氣流速為30 mL/min，電子捕獲檢測器(ECD)溫度為350 ℃，分析柱溫度為55 ℃，進(jìn)樣量為5 mL。反芻動物甲烷排放量計算公式如下：

RCH4=(RSF6/6.518)×([CH4]/[SF6])×103。

式中：RCH4是甲烷排放速率(L/d)；RSF6是SF6滲透速率(mg/d)；6.518是SF6的密度(kg/m3)；[CH4]是樣品氣體中甲烷濃度(×10-6摩爾分?jǐn)?shù))；[SF6]是樣品氣體中SF6濃度(×10-12摩爾分?jǐn)?shù))。

1.7 未知樣品拷貝數(shù)

未知樣品拷貝數(shù)計算公式[15]如下：

未知樣品拷貝數(shù)=[10(Ct1-50.063)/-3.543/10(Ct2-49.217)/-3.029]×1010。

式中：Ct1為目的基因Ct值；Ct2為內(nèi)參基因Ct值；指數(shù)(10)為膠回收產(chǎn)物中目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線拷貝數(shù)與內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線拷貝數(shù)的比值。

1.8 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛甲烷排放量的影響

由表5可知，Ⅰ組甲烷排放量較Ⅱ、Ⅲ組極顯著降低了33.13%、67.89%(P<0.01)。

表5 荷斯坦公牛甲烷排放量Table 5 Methane production of Holstein bulls L/d

2.2 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛瘤胃古菌的影響

由圖7可知，大部分樣本量的稀釋曲線在序列數(shù)為60 000～80 000時趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多測序數(shù)據(jù)對于產(chǎn)生新的OTUs邊際效應(yīng)較小。這說明該樣本量可反映瘤胃古菌的真實情況。

由表6可知，各組的覆蓋率(goods-coverage)均為1.000，說明測序深度高，足以反映古菌的菌群多樣性和豐富度。Ⅲ組Chao1指數(shù)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，系統(tǒng)發(fā)育樹(PD_whole_tree)極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)。

表6 Alpha多樣性指數(shù)Table 6 Alpha diversity index

由表7可知，各組甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)在瘤胃古菌中占絕對優(yōu)勢，其相對豐度≥97%。Ⅲ組甲烷短桿菌屬相對豐度高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)。

表7 荷斯坦公牛屬水平瘤胃古菌組成 Table 7 Composition of rumen archaea of Holstein bulls at genus level %

Beta多樣性是對不同樣品的微生物菌落進(jìn)行比較分析，非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)屬于Beta多樣性的一種分析方法，可以用于研究不同樣品的相似性，構(gòu)建樣品的聚類樹，對樣品進(jìn)行聚類分析。由圖8可知，Ⅰ、Ⅱ組樣品瘤胃古菌菌群相似度較高，故聚于一類。

Lg1.1～Lg1.8、Lg2.1～Lg2.8、Lg3.1～Lg3.8分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組瘤胃液樣品稀釋曲線。Lg1.1 to Lg1.8, Lg2.1 to Lg2.8 and Lg3.1 to Lg3.8 were the dilution curves of rumen fluid samples in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, respectively.圖7 稀釋曲線Fig.7 Dilution curve

2.3 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌的功能預(yù)測

由圖9可知，Ⅰ組荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌產(chǎn)甲烷途徑有4種，包括CO2/H2還原途徑、甲烷生成途徑、暗氫氧化途徑、氫營養(yǎng)型途徑；Ⅱ組荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌產(chǎn)甲烷途徑有5種，包括CO2/H2還原途徑、甲烷生成途徑、暗氫氧化途徑、氫營養(yǎng)型途徑、乙酸發(fā)酵途徑；Ⅲ組荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌產(chǎn)甲烷途徑有7種，包括乙酸發(fā)酵途徑、甲基化合物/H2還原途徑、甲酸生成甲烷途徑、固氮途徑、化能異養(yǎng)、甲基原子團(tuán)失衡生成甲烷途徑、其他途徑。這說明各組甲烷產(chǎn)生途徑存在差異。

基于功能基因的主成分分析(PCA)表示，如果樣品的功能組成越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。由圖10可知，Ⅰ、Ⅱ組功能組成較為接近。

methanogenesis by_CO2 reduction with H2：CO2/H2還原途徑；methanogenesis：甲烷生成途徑；dark_hydrogen_oxidation：暗氫氧化途徑；hydrogenotrophic_methanogenesis：氫營養(yǎng)型途徑；acetoclastic_methanogenesis：乙酸發(fā)酵途徑；methanogenesis_by_reduction_of_methyl_compounds_with H2：甲基化合物/H2還原途徑；methanogenesis_using_formate：甲酸生成甲烷途徑；nitrogen_fixation：固氮途徑；chemoheterotrophy：化能異養(yǎng) methanogenesis_by_disproporionation of metyl groups：甲基原子團(tuán)失衡生成甲烷途徑；others：其他途徑。圖9 PICRUSt功能基因預(yù)測聚類熱圖Fig.9 PICRUSt functional genes predicted clustering heat map

圖10 基于功能基因的PCAFig.10 PCA based on functional gene

2.4 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量的影響

由表8可知，各組之間反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量存在極顯著差異(P<0.01)。

表8 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量的影響Table 8 Effects of dietary NDF/starch ratio on Methanobrevibacter ruminantium number of Holstein bulls ×109個

3 討 論

3.1 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛甲烷排放量的影響

反芻動物的甲烷排放量約占畜牧業(yè)總甲烷排放量的81%，其中90%是由瘤胃微生物甲烷菌產(chǎn)生[22]，甲烷作為飼料發(fā)酵的終產(chǎn)物也意味著機(jī)體能量損失，如果將這些能量在飼料轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化為瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物的能量在能量守恒理論上可用于動物的生產(chǎn)。因此，降低甲烷排放量有助于提高動物的生產(chǎn)效率。

反芻動物甲烷生成量受采食量、飼料種類、飼養(yǎng)水平、飼喂次數(shù)等因素的影響[23]。合理調(diào)控飼糧精粗比是減少甲烷排放量的關(guān)鍵。研究表明，當(dāng)飼糧精料比例從0提高到70%，瘤胃甲烷排放量可降低40%[24]。與高纖維飼糧相比，高淀粉飼糧能降低甲烷排放量[25]。丁靜美等[10]研究表明，NDF/NFC比值為2.32飼糧組的肉羊甲烷排放量顯著高于NDF/NFC比值為1.58和1.04飼糧組。淀粉是NFC主要成分，是機(jī)體重要的能量供應(yīng)來源，淀粉較NFC測定準(zhǔn)確，用飼糧NDF/淀粉比值來反映飼糧易發(fā)酵程度和瘤胃發(fā)酵特性更為直觀。本試驗研究結(jié)果表明，飼糧NDF/淀粉比值為1.63組的荷斯坦公牛甲烷排放量顯著高于飼糧NDF/淀粉比值為1.13和1.38組，這與Popova等[8]研究結(jié)果一致，其原因是隨著飼糧淀粉水平的升高，產(chǎn)甲烷菌的活性會降低，甲烷排放量隨之減少。

ck1、ck2、ck3分別代表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。下圖同。ck1, ck2 and ck3 represented for groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, respectively. The same as below.圖8 UPGMA聚類樹Fig.8 UPGMA cluster tree

3.2 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛瘤胃古菌多樣性的影響

Alpha多樣性是用于分析樣品內(nèi)物種的豐富度和多樣性[26]。研究表明，纖維攝入能夠提高產(chǎn)甲烷菌群多樣性，表現(xiàn)為與高淀粉飼糧組比，高纖維飼糧組Shannon指數(shù)更高[27-28]，原因是飼糧組成會通過影響產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷途徑或基于基因水平的差異對產(chǎn)甲烷過程起重要作用[29]。研究表明，補(bǔ)飼精料組瘤胃甲烷菌群組成發(fā)生顯著變化。本試驗中，飼糧NDF/淀粉比值為1.63組Chao1指數(shù)顯著高于飼糧NDF/淀粉比值為1.13組(P<0.05)，PD_whole_tree極顯著高于飼糧NDF/淀粉比值為1.13組，這與楊碩[7]的研究結(jié)果一致。這說明隨飼糧NDF/淀粉比值的增加瘤胃古菌物種多樣性有所提高，原因可能是高飼糧NDF/淀粉比值促進(jìn)了纖維分解菌、原蟲、纖毛蟲、真菌的增殖，促進(jìn)了以不同底物為生的甲烷菌的生長繁殖和甲烷合成途徑的多樣性，菌群種類更加豐富；也可能是宿主動物個體差異對瘤胃產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了較大影響[30]。

飼糧組成是影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌種群組成的因素之一[31]。研究表明，高淀粉飼糧能夠顯著降低甲烷排放量，且瘤胃甲烷排放量與產(chǎn)甲烷菌密切相關(guān)[31]。飼糧精料比例增加能夠提高優(yōu)勢菌群相對豐度[7]。本試驗中，各組瘤胃甲烷短桿菌屬在古菌中占絕對優(yōu)勢。飼糧NDF/淀粉比值為1.63組甲烷短桿菌屬相對豐度高于其他2組，其他2組之間甲烷短桿菌屬相對豐度無顯著差異，而各組之間甲烷排放量均存在極顯著差異，說明飼糧NDF/淀粉比值不僅對甲烷短桿菌屬相對豐度產(chǎn)生了影響，也在種水平數(shù)量上產(chǎn)生了較大影響。

3.3 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌的功能預(yù)測

PICRUSt能夠根據(jù)標(biāo)記物基因(如16S rRNA)對元基因組進(jìn)行功能預(yù)測[32]。金磊等[33]基于高通量測序技術(shù)對山羊盲腸進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，盲腸菌群對山羊營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝影響較大。本試驗中，各組之間甲烷產(chǎn)生途徑存在明顯差異，這與UPGMA聚類樹、基于功能基因的PCA結(jié)果相似，高飼糧NDF/淀粉比值組的荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌的甲烷生成途徑多于中、低飼糧NDF/淀粉比值組；而從實測甲烷排放量可知，高飼糧NDF/淀粉比值組的甲烷排放量是中、低糧NDF/淀粉比值甲烷排放量之和的1.25倍。這說明瘤胃古菌多樣性提高是甲烷排放量大幅提高的主要誘導(dǎo)因素。

3.4 飼糧NDF/淀粉比值對荷斯坦公牛反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量的影響

高通量測序技術(shù)主要基于OTUs進(jìn)行結(jié)果分析，但序列數(shù)并不能完全反映所代表細(xì)菌相對豐度[34]。研究表明，高通量測序技術(shù)可能會高估或低估一些微生物類群的豐度或多樣性(如死的生物也被檢測到)[35]。一項研究指出，實時定量PCR能夠準(zhǔn)確檢測綿羊瘤胃未知細(xì)菌的種群大小及分布情況[36]。因此，實時定量PCR技術(shù)可能是檢測古菌種數(shù)量的重要途徑。

相對定量PCR是將待測靶基因片段和內(nèi)參基因片段同時擴(kuò)增，就兩者Ct值之差進(jìn)行測量[18]。陳小連[37]對3種瘤胃優(yōu)勢纖維菌絕對定量與相對定量的比較發(fā)現(xiàn)，2種方法都能準(zhǔn)確測定瘤胃微生物數(shù)量。反芻獸甲烷短桿菌屬于甲烷短桿菌屬，能夠從奶牛、公牛、鹿[38-39]瘤胃中分離得到。甲烷短桿菌屬屬于甲烷桿菌科，是氫營養(yǎng)型甲烷菌[40]，對甲烷產(chǎn)生貢獻(xiàn)率較大[41]，且在荷斯坦公牛瘤胃古菌中為優(yōu)勢甲烷菌。因此，本試驗采用絕對定量方法對反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測。從絕對定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組之間反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量有極顯著差異。這說明飼糧NDF/淀粉比值對種水平甲烷短桿菌具有顯著影響。楊碩[7]研究表明，采食高纖維含量牧草的絨山羊瘤胃以乙酸發(fā)酵為主，從而生成大量的H2，導(dǎo)致以此為生長底物的甲烷菌大量繁殖，且瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量隨纖維降解菌的升高而增多。本試驗中，低飼糧NDF/淀粉比值組荷斯坦公牛瘤胃反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量顯著低于其他2組，說明低NDF/淀粉比值的飼糧改變了荷斯坦公牛瘤胃發(fā)酵模式，瘤胃丙酸利用菌與產(chǎn)甲烷菌競爭H2產(chǎn)生丙酸，減少了產(chǎn)甲烷菌可利用底物，導(dǎo)致反芻動物甲烷菌株受到抑制。

4 結(jié) 論

降低飼糧NDF/淀粉比值能夠減少甲烷排放量，降低瘤胃古菌豐富度指數(shù)，降低甲烷短桿菌屬相對豐度和反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量，并減少了荷斯坦公牛瘤胃甲烷菌生成甲烷途徑。