沈義媛 詹經(jīng)緯 李 欣 牛 慧 吳富鑫 關(guān)淑文 童津津* 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛奶作為重要的高營養(yǎng)動物蛋白質(zhì)產(chǎn)品，包含了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高免疫力等功效。牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì)受到較多因素的影響，主要包括奶牛的遺傳改良、飼養(yǎng)管理和飼糧組成等[1-2]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在相同的飼糧和管理條件下，一些奶牛有相對較高的產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)，這可能成為提高生產(chǎn)效益的新性狀[3]。瘤胃作為反芻動物所特有的生物反應(yīng)器，使奶牛將復(fù)雜難解的植物降解為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨基酸、葡萄糖(GLU)和甘油等乳前體物。本團(tuán)隊前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)奶牛瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)和氨基酸含量顯著高于低產(chǎn)奶牛，并驗證了高、低產(chǎn)奶牛瘤胃發(fā)酵過程中瘤胃微生物的重要調(diào)節(jié)作用，從瘤胃發(fā)酵的角度解釋了高、低產(chǎn)奶牛生產(chǎn)性能的顯著差異，但是沒有全面考慮奶牛機(jī)體的能量代謝。

近年來，血液生化指標(biāo)如血清GLU、非酯化脂肪酸(NEFA)、尿素氮(UN)和膽固醇含量等已經(jīng)廣泛用于反映奶牛的代謝和健康狀況。田超等[6]的研究表明，圍產(chǎn)期奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)時，血液中NEFA含量升高，可能會導(dǎo)致乳脂含量增加、乳蛋白含量降低。Maeda等[7]通過連續(xù)檢測泌乳奶牛的血清生化指標(biāo)，如GLU、總膽固醇(TC)、脂聯(lián)素(ADN)等含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADN可以調(diào)節(jié)瘤胃酸中毒所引起炎癥反應(yīng)，并改善脂多糖引起的胰島素抵抗，并推測ADN可作為瘤胃酸中毒的評估指標(biāo)。曲明姿[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激情況下，高產(chǎn)奶牛血清中極低密度脂蛋白(VLDL)、載脂蛋白B100(ApoB-100)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量顯著高于低產(chǎn)奶牛，證明高產(chǎn)奶牛肝臟運(yùn)輸甘油三酯(TG)的能力更強(qiáng)。但是，對于相同飼養(yǎng)條件下，不同泌乳水平奶牛間瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血清生化指標(biāo)及其與泌乳性能相關(guān)性分析未見報道。

因此，本研究通過對不同泌乳水平奶牛的乳成分、瘤胃發(fā)酵及血清代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以期從機(jī)體代謝的角度進(jìn)一步解釋高、低產(chǎn)奶牛瘤胃發(fā)酵和營養(yǎng)利用差異的內(nèi)在機(jī)制，為奶牛營養(yǎng)調(diào)控和科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

本試驗采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，選擇24頭體況良好的荷斯坦奶牛，按產(chǎn)奶量分為高產(chǎn)組[(41.7±4.8) kg/d]和低產(chǎn)組[(24.1±3.9) kg/d]，各12頭，本試驗所用奶牛體重[(648.50±68.65) kg]、胎次[(2.64±0.70)胎]和泌乳天數(shù)[(182.0±31.5) d]均相近。每天07:00、13:00和18:00對奶牛進(jìn)行投料，自由采食和飲水，早、中、晚共擠奶3次?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 奶樣的采集與測定

使用牛場連接有采樣器的擠奶設(shè)施采集2組奶牛的奶樣，按早、中、晚為4∶3∶3的比例混合，采樣前在50 mL離心管中添加防腐劑重鉻酸鉀，混合均勻后貯存到4 ℃冰箱中，及時送到北京市奶牛中心，用LACTOSCAN型全自動超聲波乳成分分析儀進(jìn)行乳成分分析，測定指標(biāo)如下：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、乳體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count,SCC)及乳尿素氮和總固形物含量。

1.2.2 瘤胃液的采集與測定

在晨飼前2 h，使用口腔采樣器采集2組奶牛的瘤胃液，丟棄第1次抽取出的瘤胃液約100 mL，固定好口腔導(dǎo)管抽取第2次瘤胃液，立即使用便攜式pH計測定瘤胃液pH，4層紗布過濾后分裝于50 mL離心管，-20 ℃保存，于實驗室測定氨態(tài)氮(NH3-N)、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸含量。NH3-N含量采用Weatherburn[9]建立的比色法進(jìn)行測定，取瘤胃液6 mL于10 mL離心管中，12 000 r/min離心20 min，取出上清液40 μL，分別加入A液(苯酚顯色劑)2.5 mL、B液(次氯酸鹽試劑)2.0 mL，渦旋振蕩均勻，將樣品放置37 ℃水浴中顯色30 min。使用分光光度計，在波長550 nm處測定樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣品中NH3-N含量；VFA含量采用Qin[10]建立的毛細(xì)管柱氣相色譜法測定，取5 mL瘤胃液，在10 000 r/min離心10 min，移取1.5 mL上清液至離心管中，加0.15 mL 25 %偏磷酸，用渦流混合器搖勻，靜置30 min，在10 000 r/min下離心15 min，取上清液供氣相色譜儀測定。色譜柱條件：DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 pm)；柱溫：100 ℃，2 ℃/min至120 ℃，維持10 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：280 ℃；恒壓：21.8 kPa；分流比：1∶50；進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.3 血樣的采集與測定

在晨飼前2 h，用含肝素鈉抗凝的真空采血管進(jìn)行尾靜脈采血，采集血樣10 mL,立即以3 000 r/min離心15 min得到血清，并用移液槍分裝到5 mL離心管中，-20 ℃保存待測。血液樣品所有測定指標(biāo)均在北京華英生物技術(shù)研究所完成，其中血清白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6含量采用酶免法測定，其余指標(biāo)均為比色法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 21.0進(jìn)行處理，并進(jìn)行t檢驗，P<0.05表示統(tǒng)計差異顯著，P<0.01表示統(tǒng)計差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同泌乳水平奶牛乳成分比較

由表2可知，高產(chǎn)組奶牛的產(chǎn)奶量、4%校正乳(4%FCM)產(chǎn)量以及能量校正乳(ECM)產(chǎn)量均極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)。從乳成分來看，高產(chǎn)組奶牛的乳脂、乳蛋白和乳糖含量均極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)，總固形物含量顯著高于低產(chǎn)組(P<0.05)，乳蛋白率極顯著低于低產(chǎn)組(P<0.01)，但乳脂率、乳糖率、SCC與低產(chǎn)組差異不顯著(P>0.05)。

表2 高、低產(chǎn)奶牛乳成分比較Table 2 Comparison of milk composition between high and low lactating dairy cows

2.2 不同泌乳水平奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)比較

由表3可知，高產(chǎn)組瘤胃液TVFA、丙酸、丁酸含量極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)，乙酸含量顯著高于低產(chǎn)組(P<0.05)，pH和氨態(tài)氮、異丁酸、戊酸和異戊酸含量與低產(chǎn)組差異不顯著(P>0.05)。

表3 高、低產(chǎn)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 Rumen fermentation parameters between high and low lactating dairy cows

2.3 不同泌乳水平奶牛血清能量代謝比較

由表4可知，高產(chǎn)組血清中β-羥丁酸(BHBA)含量極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)，NEFA含量顯著高于低產(chǎn)組(P<0.05)，而GLU和TG含量極顯著低于低產(chǎn)組(P<0.01)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量顯著低于低產(chǎn)組(P<0.05)，但高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和UN含量與低產(chǎn)組差異不顯著(P>0.05)。

表4 高、低產(chǎn)奶牛血清能量代謝指標(biāo)比較Table 4 Comparison of serum energy metabolism indexes between high and low lactating dairy cows

2.4 不同泌乳水平奶牛血清抗氧化指標(biāo)比較

由表5可知，高產(chǎn)組血清中丙二醛(MDA)含量顯著高于低產(chǎn)組(P<0.05)，總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著低于低產(chǎn)組(P<0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性與低產(chǎn)組差異不顯著(P>0.05)。

表5 高、低產(chǎn)奶牛血清抗氧化指標(biāo)比較Table 5 Comparison of serum antioxidant indexes between high and low lactating dairy cows

2.5 不同泌乳水平奶牛血清免疫性能的比較

由表6可知，高產(chǎn)組血清中IL-2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量極顯著低于低產(chǎn)組(P<0.01)，免疫球蛋白G(IgG)、IL-6含量顯著低于低產(chǎn)組(P<0.05)，而免疫球蛋白M(IgM)含量顯著高于低產(chǎn)組(P<0.05)。

表6 高、低產(chǎn)奶牛血清免疫性能比較Table 6 Comparison of serum immune indexes between high and low lactating dairy cows

3 討 論

3.1 不同泌乳水平奶牛的乳成分和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的差異分析

奶牛的乳成分與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的變化，不僅受到飼糧組成、飼養(yǎng)管理、遺傳以及環(huán)境應(yīng)激等因素的影響，奶牛自身的消化代謝機(jī)制也起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，高產(chǎn)組和低產(chǎn)組奶牛瘤胃中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸含量存在顯著性差異。反芻動物所需的營養(yǎng)主要來源于飼糧中的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)被分解為可吸收的物質(zhì)，如VFA、氨基酸和GLU等。據(jù)報道，瘤胃在發(fā)酵的過程中可以產(chǎn)生的大量VFA，供給動物機(jī)體70%左右的能量[13]，而且多項研究證實，瘤胃內(nèi)進(jìn)行乙酸和丙酸發(fā)酵，乙酸參與了三羧酸循環(huán)，進(jìn)行氧化供能或用于脂肪酸合成，丙酸是糖異生的前體物質(zhì)，也是反芻動物所需GLU的主要來源。Zhao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著奶牛飼糧中粗飼料的變化，瘤胃微生物的區(qū)系結(jié)構(gòu)也發(fā)生顯著的變化，進(jìn)而影響瘤胃微生物的代謝，改變微生物蛋白和VFA的產(chǎn)量。Tong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同泌乳水平奶牛的瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃代謝產(chǎn)物之間存在顯著差異，這對調(diào)節(jié)乳合成前體物的生成具有重要的影響。由此可見，高產(chǎn)奶牛可以利用飼糧促進(jìn)合成更多的乳合成前體物，如VFA作為反芻動物的能量來源、微生物蛋白作為反芻動物氨基酸代謝和乳蛋白合成氨基酸的來源，這是導(dǎo)致奶牛不同產(chǎn)奶量的主要因素之一[15]。因此，瘤胃發(fā)酵對奶牛的生產(chǎn)性能及宿主健康等的影響具有重要的作用，而能夠靶向調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵模式的技術(shù)手段更值得深入的研究。

乳腺中將近1/2的脂肪酸來自乙酸、BHBA等前體物質(zhì)的合成，其他則從血液中吸收而來。乳脂合成是乳脂前體物在相關(guān)脂肪合成酶的作用下完成的。據(jù)報道，奶牛乳汁中的脂肪酸合成主要通過2條通路：1)乳腺從頭合成，飼糧在瘤胃中經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，大部分被瘤胃壁吸收進(jìn)入血液，此時丁酸合成BHBA，乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)饺橄俳M織中；2)從血液中獲取長鏈脂肪酸，飼糧中的脂肪被瘤胃微生物脂肪酶水解，繼而發(fā)生生物氫化，脂肪酸以NEFA的形式經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)乳腺合成乳脂。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)奶牛的乳脂產(chǎn)量顯著高于低產(chǎn)組。Sofyan等[16]的研究表明，高產(chǎn)組奶牛膽固醇、BHBA含量顯著高于低產(chǎn)組，且高產(chǎn)組奶牛瘤胃內(nèi)丁酸含量與血清中BHBA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。與之相一致，本研究的結(jié)果顯示高產(chǎn)組奶牛瘤胃液中乙酸、丁酸的含量以及血清中BHBA含量均顯著高于低產(chǎn)組，證實了乳脂產(chǎn)量與瘤胃發(fā)酵、血液調(diào)節(jié)脂肪酸合成的相關(guān)性。由此可見，高、低產(chǎn)奶牛在瘤胃發(fā)酵合成乳前體物的差異可作為高效靶點，對瘤胃發(fā)酵進(jìn)行有效地調(diào)控，可以更好地發(fā)揮動物的生產(chǎn)性能，維持動物健康。

TG、LDL-C、HDL-C是血脂的重要組成部分[17]，脂質(zhì)動員產(chǎn)生的NEFA在肝臟中被酯化為TG，以VLDL的形式入血，在本研究中，高產(chǎn)奶牛血清中NEFA、TG含量顯著低于低產(chǎn)組，提示高產(chǎn)奶牛脂質(zhì)動員程度可能低于低產(chǎn)奶牛，這與張輝等[18]、武雪會等[19]的研究相反。LDL-C是一種用來反映低密度脂蛋白(LDL)水平的指標(biāo)，LDL是由VLDL轉(zhuǎn)變而來的，可以在肝臟中結(jié)合膽固醇并將其運(yùn)輸?shù)饺砀魈幖?xì)胞。本研究中高產(chǎn)奶牛血清LDL-C含量顯著低于低產(chǎn)組，這可能是因為高產(chǎn)組血清TG含量顯著降低導(dǎo)致VLDL形式入血減少，進(jìn)而導(dǎo)致LDL-C含量降低。

先前的研究表明，丙酸提供了奶牛體內(nèi)近50%的GLU，肝臟利用丙酸生產(chǎn)的GLU大多數(shù)被合成乳糖[20]。本試驗結(jié)果表明，高產(chǎn)組奶牛的乳糖含量顯著高于低產(chǎn)組，瘤胃液丙酸含量極顯著高于低產(chǎn)奶牛，這與Sofyan等[16]的研究結(jié)果一致，即高產(chǎn)奶牛能產(chǎn)生更多的乳糖前體物質(zhì)丙酸，從而為乳糖的合成提供了充足的保障。然而，高產(chǎn)奶牛血清GLU含量顯著低于低產(chǎn)奶牛，這可能是因為奶牛機(jī)體首先利用血糖為泌乳供能，而高產(chǎn)牛需要更多的能量維持泌乳，從而導(dǎo)致高產(chǎn)組奶牛血清中的GLU含量較低。UN和NH3-N是評價奶牛蛋白質(zhì)代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)，在本試驗中，NH3-N和UN含量都沒有顯著差異，但是瘤胃內(nèi)NH3-N含量在高產(chǎn)奶牛中較高，血清UN含量在高產(chǎn)奶牛中較低，提示高產(chǎn)奶牛有較高的蛋白質(zhì)降解能力的同時，可以更好地利用NH3-N合成微生物蛋白，而低產(chǎn)奶牛則是通過肝臟將過量的氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩剡M(jìn)入到血液[19]，這在一定程度上解釋了高產(chǎn)組奶牛乳蛋白含量顯著高于低產(chǎn)組的原因。其中，值得注意的是，高產(chǎn)組奶牛的乳蛋白率顯著低于低產(chǎn)組奶牛，與牛慧等[21]、Nasr等[22]的研究相一致，這可能是牛奶的稀釋效應(yīng)所引起的。

3.2 不同泌乳水平奶牛血清抗氧化和免疫指標(biāo)的差異分析

奶牛的日常代謝活動會產(chǎn)生大量的自由基和其他生物活性物質(zhì)，此時，機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以清除過量的自由基以維持機(jī)體的平衡狀態(tài)。在應(yīng)激條件下，抗氧化酶(如CAT、SOD、GSH-Px)的活性降低，機(jī)體的防御系統(tǒng)無法及時清除大量自由基繼而引起炎癥反應(yīng)。因此，反芻動物血清中MDA含量和抗氧化酶活性通常用作確定氧化和應(yīng)激程度的生理指標(biāo)[23]。其中，SOD是動物體內(nèi)的金屬性抗氧化酶，在GSH-Px共同作用下清除體內(nèi)氧化物質(zhì)，SOD活性降低，表明機(jī)體抗氧化能力下降；MDA是動物機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA含量越低，表明動物機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)[24]。L?hrke等[25]的研究表明，與低產(chǎn)奶牛相比，高產(chǎn)奶牛血液中脂質(zhì)過氧化物的含量明顯升髙。與前人結(jié)果一致，在本試驗中，高產(chǎn)奶牛血清中MDA含量顯著高于低產(chǎn)組，且抗氧化酶T-AOC、SOD活性顯著低于低產(chǎn)組，證明高產(chǎn)奶牛清除自由基、抗氧化能力較弱。此外，有研究表明，奶牛NEFA和BHBA的大量動員與自由基產(chǎn)生的增加有關(guān)，并促進(jìn)了MDA含量的增加[26]，但在本試驗中沒有體現(xiàn)。

抗體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可作為機(jī)體的第1道防線來抵抗感染。其中，IgM和IgG是最重要的2類免疫球蛋白[27]。有研究表明，IgM的抗氧化應(yīng)激能力比IgG更強(qiáng)[28]，此外，Reyneveld等[29]的報道指出，高水平的IgM可以抗氧化低密度脂蛋白(LDL)，而高水平的IgG會結(jié)合LDL，這可能促進(jìn)動脈粥樣硬化。在本試驗中，高產(chǎn)奶牛血清中IgM含量顯著高于低產(chǎn)奶牛，IgG含量顯著低于低產(chǎn)奶牛，這提示高產(chǎn)奶牛需要通過更強(qiáng)的免疫反應(yīng)中和體內(nèi)的氧化應(yīng)激。研究表明，促炎因子可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其功能活性，起到抵抗疾病，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用。在本試驗中，高產(chǎn)奶牛血清中的促炎因子IL-2、IL-6、TNF-α含量顯著低于低產(chǎn)奶牛，表明高產(chǎn)奶牛的免疫性能較低，這與張輝等[18]的研究一致，即隨著產(chǎn)奶量的升高，奶牛的抵抗力下降。綜上所述，高、低產(chǎn)奶牛之間的免疫力和抗應(yīng)激能力存在顯著性差異，此外證明高產(chǎn)奶牛比低產(chǎn)奶牛承擔(dān)了更多的應(yīng)激壓力。

4 結(jié) 論

在相同的飼養(yǎng)和管理條件下，不同泌乳水平奶牛的瘤胃發(fā)酵能力存在顯著差異，高產(chǎn)奶牛比低產(chǎn)奶牛的瘤胃發(fā)酵能力更強(qiáng)，可以產(chǎn)生更多的乳前體物質(zhì)。此外，不同泌乳水平奶牛血清代謝指標(biāo)的差異表明，高產(chǎn)奶牛能夠更加有效地利用這些前體物質(zhì)合成乳內(nèi)容物，因此，高產(chǎn)奶牛乳中的乳脂、乳糖、乳蛋白及乳總固形物含量顯著高于低產(chǎn)奶牛。與此同時，由于代謝旺盛，高產(chǎn)奶牛的免疫性能和抗氧化能力較低。因此，為提高奶牛的產(chǎn)奶量，不僅要對瘤胃發(fā)酵進(jìn)行有效調(diào)控，還應(yīng)該改善高產(chǎn)奶牛的抗應(yīng)激能力。