李胤豪 張清月 郭曉宇 閆素梅 史彬林 趙艷麗

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

當(dāng)代肉雞產(chǎn)業(yè)規(guī)?；c集約化生產(chǎn)中，由于其飼養(yǎng)周期短、密度大，肉雞新陳代謝旺盛，很容易發(fā)生氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激，引發(fā)一系列疾病致使經(jīng)濟(jì)效益下降。現(xiàn)如今，畜禽生產(chǎn)中飼料端全面禁抗，人們更多地關(guān)注通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，即通過(guò)在飼糧中添加無(wú)毒無(wú)害的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而控制疾病感染。維生素A是保證動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一種脂溶性維生素，它不僅對(duì)動(dòng)物維持正常的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)生長(zhǎng)與生殖、維持視覺(jué)功能和抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要的生理作用，而且可以提高機(jī)體抗氧化和清除自由基能力，防御細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生，對(duì)動(dòng)物機(jī)體抗氧化和免疫功能有著重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。因此，肉雞生產(chǎn)中常使用維生素A來(lái)提高其抗氧化和免疫功能。

一氧化氮(NO)是迄今為止生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)氣體信號(hào)分子，是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、脂溶性且易通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散的生物自由基，是機(jī)體重要的生物介質(zhì)。體內(nèi)的NO主要是由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)催化左旋-精氨酸(L-Arg)與氧氣分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成[4]。NO作為信使參與機(jī)體內(nèi)多種生物學(xué)反應(yīng)，對(duì)血管通透性、炎癥反應(yīng)和免疫功能等具有重要的調(diào)節(jié)作用，并能影響機(jī)體的某些免疫細(xì)胞的生成和活力，例如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等[5]。研究表明，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的NO含量在一定范圍內(nèi)與其抗氧化和免疫功能呈正相關(guān)關(guān)系，但過(guò)量的NO對(duì)細(xì)胞具有毒性，容易引起細(xì)胞損傷[6]。維生素A可有效調(diào)控NO合成，提高機(jī)體抗氧化水平并清除自由基，預(yù)防細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激的發(fā)生[7]。其可能的機(jī)制是維生素A及其代謝產(chǎn)物視黃酸抑制了淋巴細(xì)胞中某些細(xì)胞因子的合成，抑制由此類(lèi)細(xì)胞因子介導(dǎo)的iNOS的合成，從而抑制NO的生成[8]。體外試驗(yàn)也表明，添加維生素A抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中受白細(xì)胞介素-1(IL-1)介導(dǎo)的iNOS的合成，減少NO的大量生成從而緩解細(xì)胞損傷[9]。這提示維生素A可能是通過(guò)影響NO的生成從而調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化與免疫功能。本課題組前期的研究表明，飼糧添加6 000 IU/kg的維生素A能夠提高肉雞的生長(zhǎng)性能，添加15 000 IU/kg的維生素A能夠提高肉雞抗氧化功能，飼糧維生素A水平達(dá)到30 000～45 000 IU/kg時(shí)，肉雞生長(zhǎng)性能和抗氧化功能均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[2]，但不同的維生素A添加水平對(duì)肉雞的免疫功能的影響及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。鑒于此，本試驗(yàn)擬研究飼糧添加不同水平的維生素A對(duì)肉雞免疫功能以及肝臟和十二指腸中NO含量、iNOS、總一氧化氮合酶(tNOS)的活性與其基因相對(duì)表達(dá)量的影響，為闡明維生素A通過(guò)調(diào)控NO途徑影響肉雞免疫功能的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)設(shè)計(jì)、飼養(yǎng)管理與基礎(chǔ)飼糧配方等同本課題前期郭曉宇等[2]的試驗(yàn)，簡(jiǎn)介如下：采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取240只1日齡健康的愛(ài)拔益加(AA)肉雞(公母各占1/2)，隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只。5組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加3 000、6 000、15 000、30 000和45 000 IU/kg維生素A的飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)期 42 d，分為前期(1～3周齡)和后期(4～6周齡)，各21 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

3)代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。 ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.2 樣品采集

在21和42日齡，晨飼前在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只雞，即每組12只雞，稱(chēng)重、翅下靜脈采血后口腔內(nèi)放血屠宰。血液于4 ℃下3 000 r/min離心10 min制備血清，-20 ℃保存，用于血清免疫因子含量的測(cè)定。在冰浴上剖開(kāi)肉雞腹腔，采集肝臟和十二指腸組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)的分析測(cè)定。迅速分離胸腺、脾臟和法氏囊等組織，用濾紙吸去血液，剝離脂肪和結(jié)締組織后分別稱(chēng)重。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 免疫器官指數(shù)

免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)指數(shù)=免疫器官重/宰前活體重。

1.3.2 血清免疫細(xì)胞因子含量

血清中免疫細(xì)胞因子IL-1、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量以及肝臟和十二指腸組織中NO含量、iNOS和tNOS活性的測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行操作。主要使用的儀器設(shè)備：全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SYNERGY H1，美國(guó)伯騰儀器有限公司)、組織勻漿儀(Retsch MM400，德國(guó)萊馳儀器有限公司)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9270，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3.3 肝臟、十二指腸組織中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量

肝臟和十二指腸組織中總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)的測(cè)定方法和程序同郭世偉[10]的方法，PCR引物由上海生工合成，引物序列詳見(jiàn)表2。iNOS基因在組織中的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05表示組間差異或回歸關(guān)系顯著，0.050.10表示組間差異或回歸關(guān)系不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞免疫器指數(shù)的影響

由表3可知，在21和42日齡，飼糧維生素A水平對(duì)肉雞法氏囊指數(shù)均有趨于顯著的影響(P=0.078，P=0.06)，21日齡以6 000 IU/kg組最高，45 000 IU/kg組最低；42日齡以15 000 IU/kg組最高，45 000 IU/kg組最低?；貧w關(guān)系表明，隨飼糧維生素A水平的升高，21日齡肉雞脾臟指數(shù)呈顯著的一次線性增加的劑量關(guān)系(P=0.02，R2=0.186)，以30 000 IU/kg組最高。各組肉雞胸腺指數(shù)之間的差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞免疫器指數(shù)的影響Table 3 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on immune organ indexes in broilers g/kg

2.2 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞血清免疫因子含量的影響

由表4可知，飼糧維生素A水平對(duì)21和42日齡肉雞血清中IL-1(P=0.020，P<0.001)、42日齡血清IL-6(P=0.023)和TNF-α含量(P=0.049)有顯著影響，且隨維生素A水平的提高，21和42日齡肉雞血清IL-1(P=0.009，R2=0.41；P<0.001，R2=0.47)、42日齡血清IL-6(P=0.011，R2=0.17)和TNF-α含量(P=0.050，R2=0.13)均呈顯著的二次曲線降低的劑量依賴(lài)關(guān)系，均以15 000 IU/kg組含量較高，45 000 IU/kg組含量較低；飼糧維生素A水平對(duì)42日齡肉雞血清中IL-2含量有趨于顯著的影響(P=0.075)，且隨飼糧維生素A水平的提高呈顯著的一次線性升高的劑量依賴(lài)關(guān)系(P=0.044，R2=0.79)，15 000～45 000 IU/kg組含量高于3 000～6 000 IU/kg組。

表4 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞血清免疫因子含量的影響Table 4 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on serum immune factor contents in broilers pg/dL

2.3 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞肝臟和十二指腸中NO含量以及相關(guān)代謝酶活性的影響

由表5可知，飼糧維生素A水平對(duì)42日齡肉雞肝臟中NO(P=0.001)含量及iNOS(P=0.002)和tNOS活性(P=0.001)存在顯著影響，且隨飼糧維生素A添加水平的升高均呈顯著的二次曲線下降(P<0.001，R2=0.62；P<0.001，R2=0.47；P<0.001，R2=0.49)，以3 000和6 000 IU/kg組較高，30 000和45 000 IU/kg組較低。21日齡肉雞肝臟組織中NO含量隨飼糧中維生素A水平的增加呈趨于顯著的一次線性降低(P=0.073，R2=0.13)。飼糧維生素A水平對(duì)21日齡肉雞肝臟中iNOS活性有趨于顯著的影響(P=0.082)，6 000和15 000 IU/kg組活性高于30 000和45 000 IU/kg組。

表5 飼糧添加不同水平的維生素A對(duì)肉雞肝臟中NO含量及相關(guān)代謝酶活性的影響Table 5 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on NO content and related metabolic enzyme activities in liver of broilers μmol/g prot

由表6可知，除21日齡肉雞十二指腸組織中tNOS活性在各組間無(wú)顯著差異(P=0.332)外，飼糧維生素A水平對(duì)肉雞十二指腸NO含量以及相關(guān)酶活性均有顯著影響(P<0.05)。隨維生素A添加水平的增加，21和42日齡肉雞十二指腸NO含量(P=0.001，R2=0.34；P<0.001，R2=0.70)及iNOS(P=0.009，R2=0.22；P=0.002，R2=0.29)和42日齡tNOS活性(P<0.001，R2=0.67)均呈顯著的一次線性降低，30 000和45 000 IU/kg組NO含量和相關(guān)酶活性顯著低于3 000和6 000 IU/kg組(P<0.05)。

表6 飼糧添加不同水平的維生素A對(duì)肉雞十二指腸組織NO含量及相關(guān)代謝酶活性的影響Table 6 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on NO content and related metabolic enzyme activities in duodenum of broilers μmol/g prot

2.4 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞肝臟和十二指腸中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量

由表7可知，在整個(gè)試驗(yàn)期，飼糧維生素A添加水平對(duì)肉雞肝臟和十二指腸組織中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量均存在顯著影響(P<0.05)。21日齡肉雞肝臟(P=0.003，R2=0.27)、21和42日齡肉雞十二指腸組織(P=0.001，R2=0.32；P=0.002，R2=0.30)中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量隨著維生素A添加水平的增加均呈顯著的一次線性降低(P<0.05)，30 000和45 000 IU/kg組iNOS基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于3 000、6 000和15 000 IU/kg組(P<0.05)。42日齡的肉雞肝臟中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量與飼糧維生素A添加水平呈顯著的二次曲線下降的劑量依賴(lài)關(guān)系(P=0.007，R2=0.41)，以15 000 IU/kg組相對(duì)表達(dá)量最高，30 000和45 000 IU/kg組最低。

表7 飼糧維生素A水平對(duì)肉雞肝臟和十二指腸中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量的影響Table 7 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on related expression level of iNOS gene in liver and duodenum of broilers

3 討 論

3.1 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是肉雞的三大免疫器官，胸腺位于頸靜脈附近，是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的場(chǎng)所；脾臟與體液免疫關(guān)系密切，是B淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞生成的重要場(chǎng)所[11]。法氏囊又稱(chēng)腔上囊，是禽類(lèi)獨(dú)有的免疫器官，是B淋巴細(xì)胞生成、發(fā)育和分化的主要場(chǎng)所。通常認(rèn)為免疫器官重量與其所含免疫細(xì)胞數(shù)目成正比關(guān)系，免疫器官指數(shù)反映淋巴細(xì)胞的增殖狀況，免疫器官指數(shù)增加提示機(jī)體免疫機(jī)能增強(qiáng)[12]。研究指出，維生素A可能通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的分化進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫器官的發(fā)育[13]。Yang等[14]研究表明，與對(duì)照組相比，飼糧添加9 000～12 000 IU/kg維生素A可以提高雛鵝法氏囊指數(shù)。梁靜茹等[15]研究表明，飼糧添加16 000 IU/kg的維生素A對(duì)種公鵝的脾臟生長(zhǎng)存在抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，飼糧維生素A添加水平超過(guò)15 000 IU/kg時(shí)肉雞法氏囊指數(shù)降低，30 000 IU/kg以上的維生素A添加水平使肉雞脾臟指數(shù)趨于顯著的下降，表明高水平的維生素A抑制了肉雞免疫器官的發(fā)育，從而抑制其免疫功能。

3.2 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞血清免疫因子含量的影響

細(xì)胞免疫因子是由免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)經(jīng)刺激誘導(dǎo)而合成、分泌的一類(lèi)高活性、多功能多肽或蛋白質(zhì)，可以作為細(xì)胞間的信號(hào)傳遞分子并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，如IL-1、IL-6和TNF-α等釋放在局部作用于免疫細(xì)胞，可增強(qiáng)免疫反應(yīng)[16]。有研究表明，缺乏維生素A的大鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，易出現(xiàn)腸道感染[17]，但維生素A過(guò)量也會(huì)使輔助T細(xì)胞活化途徑受損，進(jìn)而影響IL-2的分泌釋放[18]。Wang等[12]研究表明，肉雞飼糧添加5 400～10 800 IU/kg的維生素A可上調(diào)IL-1β、IL-2和TNF-α的基因表達(dá)，而當(dāng)維生素A水平達(dá)到21 600 IU/kg時(shí)，以上細(xì)胞因子的基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加超過(guò)15 000 IU/kg的維生素A時(shí)，肉雞21和42日齡血清中IL-1含量及42日齡血清中IL-6和TNF-α含量下降，提示飼糧維生素A水平超過(guò)15 000 IU/kg時(shí)，肉雞機(jī)體免疫功能開(kāi)始受到抑制，飼糧添加30 000和45 0000 IU/kg的維生素A顯著降低了血清中IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等細(xì)胞免疫因子的含量，對(duì)機(jī)體免疫功能造成不利影響，可能的原因是高劑量的維生素A降低了淋巴細(xì)胞的數(shù)量從而對(duì)肉雞免疫功能產(chǎn)生負(fù)面作用。Yuan等[19]研究表明，飼糧添加20 000 IU/kg以上的維生素A會(huì)損傷肉雞T-淋巴細(xì)胞從而使其免疫功能下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。另一方面，肉雞的胸腺、脾臟和法氏囊均是IL-1和IL-2等免疫因子合成和分泌的重要器官[20]，本研究中，30 000～45 000 IU/kg的維生素A水平降低了血清免疫因子含量，可能與高水平的維生素A抑制了肉雞法氏囊發(fā)育從而抑制了血清免疫因子的釋放有關(guān)。

3.3 飼糧添加不同水平維生素A對(duì)肉雞肝臟、十二指腸組織中NO含量、iNOS和tNOS活性以及肝臟、十二指腸iNOS基因相對(duì)表達(dá)量的影響

NO是一種高活性的氣體分子，由巨噬細(xì)胞分泌，在肝臟細(xì)胞、十二指腸細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均可生成，參與機(jī)體細(xì)胞和組織的多種生理功能，如作為機(jī)體免疫功能和神經(jīng)傳遞中的信號(hào)分子、調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的生成與分解、調(diào)節(jié)血管通透性維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等[4,21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加30 000和45 0000 IU/kg維生素A顯著降低了肉雞肝臟和十二指腸中NO含量、iNOS和tNOS的活性，且十二指腸中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，血清免疫細(xì)胞因子含量也呈相似的變化規(guī)律，這表明高添加水平的維生素A會(huì)抑制免疫器官的生長(zhǎng)，抑制免疫細(xì)胞因子的分泌和釋放，同時(shí)抑制了組織中iNOS基因相對(duì)表達(dá)量，使組織中NO的生成分泌受限，從而抑制機(jī)體免疫功能。目前，有關(guān)維生素A對(duì)NO的生成與調(diào)節(jié)作用的研究主要集中在人類(lèi)和小鼠等領(lǐng)域。研究表明，維生素A可以通過(guò)提高視黃酸受體的蛋白表達(dá)量抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的磷酸化程度，降低iNOS基因與蛋白的表達(dá)，從而降低NO含量[1,22]。Okada等[23]在體外研究中利用脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞中IL-1、IL-2以及iNOS大量生成。同樣，Dheen等[24]利用LPS刺激小鼠小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，使細(xì)胞中iNOS和TNF-α基因的表達(dá)量上升，同時(shí)生產(chǎn)大量的NO。以上結(jié)果提示，細(xì)胞免疫因子通常從多條途徑介導(dǎo)NO生成，維生素A通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子的釋放從而調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生。最近的一項(xiàng)體外試驗(yàn)表明，維生素A可以影響小鼠皮膚成纖維細(xì)胞NO的生成，并呈現(xiàn)低水平促進(jìn)而高水平抑制的劑量效應(yīng)[25]，這與本研究的結(jié)果一致，但關(guān)于維生素A調(diào)節(jié)肉雞NO生成的報(bào)道鮮見(jiàn)，具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼糧添加6 000～15 000 IU/kg的維生素A促進(jìn)了肉雞法氏囊的發(fā)育。肉雞肝臟和十二指腸組織中NO含量和iNOS、tNOS活性及iNOS基因相對(duì)表達(dá)量與飼糧維生素A添加水平呈劑量依賴(lài)關(guān)系，低劑量提高各組織NO含量，上調(diào)iNOS基因的表達(dá)，而高劑量則出現(xiàn)抑制作用。