李景上 章嘯君 陳勝昌 項(xiàng) 云 徐 娥 樓芳芳 楊 華 肖英平*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，金華 321017)

腸道微生物群落是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，存在于每個(gè)生命體中，以各種方式直接或間接地參與宿主的代謝過程，對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)、生理、免疫過程和生長(zhǎng)性能起著重要的影響[1-3]。然而，當(dāng)前對(duì)腸道微生物群落的研究大多是基于細(xì)菌群落，少有研究是針對(duì)真菌群落的[4-5]。真菌是腸道微生物的重要組成部分之一[6-8]，越來越多的證據(jù)揭示了腸道真菌群落與宿主健康有著重要聯(lián)系[9-12]。K?hler等[9]提出絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝物(包括聚酮化合物、非核糖體肽、生物堿和萜烯等)具有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和藥用的功能。此外，體外培養(yǎng)的威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)能夠在4及25 ℃下分泌具有活性的胞外脂肪酶，可通過破壞甘油分子和脂肪酸之間的酯鍵來催化甘油三酯水解，促進(jìn)脂質(zhì)分解[10]。這些研究都揭示了腸道真菌參與機(jī)體的互作，除此之外，腸道真菌還可以通過調(diào)節(jié)肝腸軸緩解一系列的代謝疾病[11-12]。因此，腸道真菌也參與機(jī)體內(nèi)部代謝及生命活動(dòng)，其作用不可缺少。

金華豬是我國(guó)著名的地方品種，有“中國(guó)熊貓豬的美譽(yù)”，具有皮薄骨細(xì)、肉質(zhì)鮮美、性成熟早、繁殖能力強(qiáng)和雜交優(yōu)勢(shì)顯著的特點(diǎn)，反之，其具有生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低、肌肉脂肪含量高等缺點(diǎn)[13-15]。鑒于腸道真菌在調(diào)節(jié)宿主生長(zhǎng)代謝中的重要作用，由此推測(cè)，金華豬的回腸、結(jié)腸真菌結(jié)構(gòu)可能與外來品種豬存在差異。然而，關(guān)于腸道真菌結(jié)構(gòu)差異對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控以及與背膘厚的相關(guān)性鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選用不同肥瘦率的金華豬為研究對(duì)象，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)探究其回腸、結(jié)腸的真菌結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步探討腸道真菌與脂肪沉積的相關(guān)性，從而為從微生物角度調(diào)控豬肉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

在金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)豬場(chǎng)選擇同批次的35頭金華豬進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，預(yù)防免疫和飼養(yǎng)管理按常規(guī)方法進(jìn)行，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平同我們前期的研究[16]，具體見表1。35頭金華豬在270日齡稱重后進(jìn)行屠宰，測(cè)定其背膘厚、眼肌面積和瘦肉率，采集回腸、結(jié)腸中段內(nèi)容物，并馬上置于液氮速凍，然后干冰轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。選擇瘦肉率最低(高脂肪組，H組)和瘦肉率最高(低脂肪組，L組)的5頭豬用于腸道真菌結(jié)構(gòu)分析。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 腸道內(nèi)容物DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取回腸、結(jié)腸內(nèi)容物DNA，并存儲(chǔ)于-80 ℃。以提取的DNA為模板，使用ITS2引物ITS3-2024F(5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4-2409R(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)真菌16S rRNA基因ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ITS測(cè)序分析[17]。

1.3 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

測(cè)序由明科生物技術(shù)(杭州)有限公司完成，基于Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)回腸、結(jié)腸內(nèi)容物真菌ITS的ITS2區(qū)域進(jìn)行掃描測(cè)序。采用QIIME軟件(http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)進(jìn)行序列的質(zhì)量控制及過濾，剔除低質(zhì)量的DNA序列，獲取高質(zhì)量的DNA序列，然后在QIIME中調(diào)用uCLUST對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度97%進(jìn)行聚類，定義為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)并利用QIIME 2軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)[香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Chao1指數(shù)(Chao1 index)和辛普森指數(shù)(Simpson index)]，使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配，并對(duì)回腸、結(jié)腸內(nèi)容物真菌群落的組成、多樣性及測(cè)序深度進(jìn)行表征，基于OTU聚類分析，繪制稀釋性曲線、真菌結(jié)構(gòu)餅圖、豐度熱點(diǎn)圖及主坐標(biāo)分析(PCoA)圖[18]，并找出不同肥瘦率金華豬的同腸段差異菌，與背膘厚做相關(guān)性分析，探究腸道真菌與脂肪沉積的關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)(t-test)進(jìn)行分析比較，P<0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同肥瘦率金華豬的胴體品質(zhì)

由圖1可知，不同肥瘦率金華豬的瘦肉率與背膘厚存在顯著差異(P<0.05)，H組金華豬瘦肉率比L組低5.49%，H組金華豬背膘厚比L組金華豬高25.36%；體重與眼肌面積H組與L組之間無顯著差異(P>0.05)。

L:L組 L group；H：H組 H group。下圖同 the same as below。圖1 不同肥瘦率金華豬的胴體品質(zhì)Fig.1 Carcass quality of Jinhua pigs with different fatness rates

2.2 不同肥瘦率金華豬回腸、結(jié)腸真菌群落Alpha多樣性分析

從稀釋曲線(圖2)可以看出，H組和L組呈現(xiàn)出明顯的差異。各樣品覆蓋度指數(shù)(Coverage index)為0.999～1.000，因此測(cè)序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)多樣性組成。

圖2 不同肥瘦率金華豬回腸(A)和結(jié)腸(B)真菌稀釋性曲線Fig.2 Fungi dilution curves in ileum (A) and colon (B) of Jinhua pigs with different fatness rates

在OTU聚類97%相似水平下，根據(jù)香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)和辛普森指數(shù)對(duì)不同肥瘦率金華豬回腸、結(jié)腸真菌的豐富度和多樣性進(jìn)行分析。在回腸段(表2)，H組香濃指數(shù)、Chao1指數(shù)顯著低于L組(P<0.05)。在結(jié)腸段(表3)，H組OTU數(shù)量、香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)顯著低于L組(P<0.05)。

表2 不同肥瘦率金華豬回腸真菌測(cè)序概況Table 2 Fungi sequencing overview in ileum of Jinhua pigs with different fatness rates

表3 不同肥瘦率金華豬結(jié)腸真菌測(cè)序概況Table 3 Fungi overview of sequencing in colon of Jinhua pigs with different fatness rates

2.3 不同肥瘦率金華豬腸道真菌PCoA

通過PCoA(圖3)發(fā)現(xiàn)，H組與L組呈現(xiàn)出明顯不同的聚類，表明二者的菌群結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3 不同肥瘦率金華豬回腸(A)和結(jié)腸(B)真菌主坐標(biāo)分析Fig.3 Fungi PCoA in ileum (A) and colon (B) of Jinhua pigs with different fatness rates

2.4 不同肥瘦率金華豬回腸、結(jié)腸真菌菌群結(jié)構(gòu)分布

在門(phylum)水平上，回腸、結(jié)腸的優(yōu)勢(shì)真菌門均為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)和葫蘆菌門(Chytridiomycota)。在回腸段(圖4)，H組子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度顯著高于L組(97.57% vs 0.58%，P<0.05)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對(duì)豐度顯著低于L組(0.49% vs 78.75%，P<0.05)。在結(jié)腸段(圖5)，H組子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度顯著高于L組(58.44% vs 1.82%，P<0.05)；H組擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對(duì)豐度顯著低于L組(0.09% vs 75.41%，P<0.05)。

在屬(genus)水平上，在回腸段(圖4)，相對(duì)豐度最高的10個(gè)菌屬為卡扎斯坦酵母屬(Kazachstania)、擔(dān)子菌酵母屬(Naganishia)、Fungi_norank、內(nèi)生真菌屬(Gloeotinia)、布拉酵母菌屬(Saccharomyces)、珊瑚菌屬(Clavaria)、曲霉菌屬(Aspergillus)、根霉菌屬(Rhizopus)、Lycoperdaccae_norank、梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)。H組Kazachstania的相對(duì)豐度顯著高于L組(85.74% vs 0.00%，P<0.05)，而Naganishia的相對(duì)豐度顯著低于L組(0.00%vs75.62%，P<0.05)。在結(jié)腸段(圖5)，相對(duì)豐度最高的10個(gè)菌屬為耐干霉菌屬(Xeromyces)、Clavaria、Kazachstania、Fungi_norank、金孢菌屬(Xerochrysium)、Aspergillus、輪枝霉屬(Verticllium)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、Naganishia、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)。H組Clavaria的相對(duì)豐度顯著高于L組(32.87% vs 0.00%，P<0.05)，而Xerochrysium的相對(duì)豐度顯著低于L組(0.00% vs 68.53%，P<0.05)。

Ascomycota：子囊菌門；Basidiomycota：擔(dān)子菌門；Mucoromycota：毛霉菌門；Chytridiomycota：葫蘆菌門；Kazachstania：扎斯坦酵母屬；Naganishia：擔(dān)子菌酵母屬；Gloeotinia：內(nèi)生真菌屬；Saccharomyces：布拉酵母菌屬；Clavaria：珊瑚菌屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Rhizopus：根霉菌屬；Sterigmatomyces：梗孢酵母屬；Others：其他。圖4 不同肥瘦率金華豬回腸真菌結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungi structure in ileum of Jinhua pigs with different fatness rates

通過對(duì)相對(duì)豐度最高的15個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬進(jìn)行熱圖(圖6和圖7)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)腸段有2個(gè)共同的差異真菌屬，Kazachstania在H組腸道中相對(duì)豐度較高，Naganishia在L組中相對(duì)豐度較高。

2.5 不同肥瘦率金華豬回腸、結(jié)腸真菌菌群與背膘厚的相關(guān)性分析

對(duì)不同肥瘦率金華豬回腸、結(jié)腸優(yōu)勢(shì)菌真屬與背膘厚進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)。Kazachstania、Saccharomyces、Aspergillus相對(duì)豐度與背膘厚均呈高度正相關(guān)(r=0.59～0.92)；Naganishia、Clavaria、Rhizopus相對(duì)豐度均與背膘厚呈負(fù)相關(guān)(r=-0.88～-0.78)(表4)。

表4 不同肥瘦率金華豬相對(duì)豐度前10真菌屬與背膘厚的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between relative abundance of top 10 fungus genera and backfat thickness of Jinhua pigs with different fatness rates

3 討 論

機(jī)體的腸道內(nèi)生存著大量的細(xì)菌、真菌等生物，其數(shù)量龐大、種類眾多，它們彼此依賴、相互制約，構(gòu)成了相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。越來越多的研究證實(shí)了腸道菌群在脂肪沉積中的作用。例如，Backhed等[19]通過將肥胖小鼠中的腸道菌群移植到無菌小鼠后發(fā)現(xiàn)即使減少食物供應(yīng)，小鼠的體脂含量仍持續(xù)增加，可見腸道菌群對(duì)脂質(zhì)代謝的作用。在最近的研究中，John等[20]指出，腸道微生物群落對(duì)肥胖的影響并不是簡(jiǎn)單的擬桿菌門與厚壁菌門的比例及其互作，真菌也可能影響代謝過程。在本試驗(yàn)中，我們證實(shí)不同肥瘦率金華豬的相同腸段真菌結(jié)構(gòu)不一樣，Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，L組金華豬回腸、結(jié)腸真菌的香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)遠(yuǎn)高于H組，這與陳鏡剛[21]探究金華豬與長(zhǎng)白豬回腸、結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)所得試驗(yàn)結(jié)果一致。腸道微生物中的大部分存在于結(jié)腸中，其數(shù)量為109～1012CFU/mL[22-23]，與此相一致，在本試驗(yàn)中結(jié)腸中真菌數(shù)量遠(yuǎn)高于回腸，且結(jié)腸中的優(yōu)勢(shì)真菌屬差異大于回腸中。前人在小鼠中的研究中證明念珠菌是腸道真菌群落中最豐富的菌屬之一[24]，然而本試驗(yàn)中鑒定得出H組金華豬回腸優(yōu)勢(shì)真菌屬為Kazachstania，L組金華豬回腸優(yōu)勢(shì)真菌屬為Naganishia，H組金華豬結(jié)腸無優(yōu)勢(shì)真菌屬，但L組金華豬結(jié)腸中優(yōu)勢(shì)真菌屬為Xeromyces，其差異可能與豬的品種及其飼養(yǎng)條件有關(guān)。后續(xù)仍需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證這3種優(yōu)勢(shì)真菌屬是否與金華豬脂肪沉積機(jī)理有一定的關(guān)聯(lián)性。

Ascomycota子囊菌門；Basidiomycota：擔(dān)子菌門；Chytridiomycota：葫蘆菌門；Mucoromycota：毛霉菌門；Xeromyces：耐干霉菌屬；Clavaria：珊瑚菌屬；Kazachstania：扎斯坦酵母屬；Xerochrysium：金孢菌屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Verticllium：輪枝霉屬；Wickerhamomyces：威克漢姆酵母屬；Naganishia：擔(dān)子菌酵母屬；Wallemia：節(jié)擔(dān)菌屬；Others：其他。圖5 不同肥瘦率金華豬結(jié)腸真菌結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungi structure in colon of Jinhua pigs with different fatness rates

Naganishia：擔(dān)子菌酵母屬；Penicillium：青霉菌屬；Phyllachora：黑痣菌屬；Clavaria：珊瑚菌屬；Rhizopus：根霉菌屬；Saccharomyces：布拉酵母菌屬；Xeromyces：耐干霉菌屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Mucor：毛霉屬；Cladosporium：枝孢屬；Alternaria：鏈格孢屬；Gloeotinia：內(nèi)生真菌屬；Lecanicillium：蠟蚧菌屬；Kazachstania：扎斯坦酵母屬；Sterigmatomyces：梗孢酵母屬。圖6 不同肥瘦率金華豬回腸真菌結(jié)構(gòu)熱圖(屬水平)Fig.6 Heat map of fungi structure in ileum of Jinhua pigs with different fatness rates (at genus level)

Naganishia：擔(dān)子菌酵母屬；Rhizopus：根霉菌屬；Clavaria：珊瑚菌屬；Phyllachora：黑痣菌屬；Fusarium：鐮刀菌屬；Saccharomyces：布拉酵母菌屬；Wallemia：節(jié)擔(dān)菌屬；Trichoderma：木霉菌屬；Ustilaginoidea：綠核菌屬；Penicillium：青霉菌屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Byssochlamys：絲衣霉菌屬；Piromyces：鞭毛菌屬；Kazachstania：扎斯坦酵母屬；Xeromyces：耐干霉菌屬。圖7 不同肥瘦率金華豬結(jié)腸真菌結(jié)構(gòu)熱圖(屬水平)Fig.7 Heat map of fungi structure in colon of Jinhua pigs with different fatness rates (at genus level)

目前前人提出具有益生作用的真菌是布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)和漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyceshanseni)，其中，布拉酵母菌的臨床試驗(yàn)顯示出其具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡的作用[25-26]，并且可以改善腹瀉等腸道炎癥疾病[27-29]。Carbonetto等[30]和Hagman等[31]指出Kazachstania能在無氧和有氧條件下發(fā)酵己糖，并將己糖轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Kazachstania相對(duì)豐度與背膘厚存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.69～0.70)，且該真菌屬是H組金華豬回腸中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，這可能與該真菌屬在腸道中分解大量的碳水化合物，提高了有機(jī)物質(zhì)的利用率有關(guān)，最終導(dǎo)致宿主的脂肪沉積。Naganishia屬于油質(zhì)酵母，其產(chǎn)生的脂質(zhì)富含單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFAs)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFAs)[32-33]，二者在細(xì)胞質(zhì)中積累成疏水性脂質(zhì)顆粒，可被細(xì)胞代謝用于膜生物合成原料和能量?jī)?chǔ)備[34]，MUFAs、PUFAs還參與機(jī)體免疫系統(tǒng)激活及機(jī)體脂肪代謝調(diào)控[35]，這些都揭示了腸道真菌可通過其代謝產(chǎn)物參與機(jī)體的脂肪代謝調(diào)控。與此一致，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Naganishia相對(duì)豐度與金華豬背膘厚存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.83～-0.79)，表明有可能是Naganishia產(chǎn)生的MUFAs以及PUFAs等代謝物促進(jìn)了機(jī)體免疫系統(tǒng)激活，并沒有用來調(diào)控機(jī)體的脂肪代謝。綜上可知，腸道真菌有可能參與了宿主脂質(zhì)沉積等代謝活動(dòng)，關(guān)于腸道真菌與脂肪代謝的具體機(jī)制，仍有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

① 金華豬回腸中優(yōu)勢(shì)真菌屬為Kazachstania、Naganishia、Gloeotinia、Saccharomyces。

② 金華豬結(jié)腸中優(yōu)勢(shì)真菌屬為Xeromyces、Clavaria、Kazachstania、Xerochrysium。

③ 金華豬腸道中Kazachstania相對(duì)豐度與背膘厚存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.69～0.70)，Naganishia相對(duì)豐度與背膘厚存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.83～-0.79)，推測(cè)這2種真菌屬可能與脂肪代謝存在一定的關(guān)系。