劉 景 陳炳鈿 何姝穎 邱華玲 繆伏榮 董志巖 李忠榮 方桂友 葉鼎承 陳 卓 陳鑫珠,4*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.中化云龍有限公司，成都 655204；3.福建商學院工商管理學院，福州 350016；4.福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司博士后工作站，福州 350008)

磷是動物體內(nèi)除鈣以外含量最為豐富的礦物元素，其參與并促進機體體內(nèi)新陳代謝，能夠提高動物生長和生產(chǎn)性能，并能防治疾病[1]。目前，飼料中的磷酸鹽添加劑產(chǎn)品主要有磷酸氫鈣(DCP)、磷酸二氫鈣(MCP)和脫氟磷酸鈣(DFP)，其次是磷酸一二鈣(MDCP)；此外還有磷酸一銨(MAP)、磷酸二銨(DAP)、磷酸鈣鎂以及尿素磷酸鹽等專用的飼料磷酸鹽，但市場使用量相對較少[2]。DCP難溶于水，動物對其有效成分的吸收率低(<60%)，其余鈣、磷隨糞便排出體外，造成生態(tài)環(huán)境磷污染[3]。MDCP是MCP和DCP的共晶結(jié)合物，動物對其有效成分的吸收率較DCP高(>75%)，且其在糞便中殘留的磷較少[4]。發(fā)達國家在畜禽飼糧中常選用磷利用效率較高的MDCP和MCP，而我國仍采用利用率較低的DCP。中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所用小雞和乳豬對MDCP的生物學效價進行研究發(fā)現(xiàn)，MDCP在消化吸收率方面比傳統(tǒng)的DCP高8個百分點，MDCP正越來越受到青睞[5]。MCP和MDCP呈酸性，系酸力低；DCP偏堿性，系酸力高。對于腸道未完全發(fā)育幼畜，斷奶等應激導致胃酸分泌不足，腸道消化酶活性降低，低系酸力飼糧能夠提高其腸道消化率，減緩斷奶應激[6]，因此，MCP和MDCP與DCP相比水溶解性更好，酸性更強，更有利于腸道健康。此外，微酸性MCP和MDCP比偏堿性的DCP適口性好，可提高采食量[7]?；诖?，本研究在無植酸酶添加的新型飼糧條件下，旨在研究育肥豬飼糧中用MDCP和MCP替代DCP的應用效果及適宜添加量，為育肥豬飼糧配制磷源的選擇提供科學依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗作用MDCP、MCP和DCP由某公司提供，均為顆粒狀。其中，MDCP中鈣和無機磷含量分別為14.7%和21.4%；MCP中鈣和無機磷含量分別為13.8%和23.0%；DCP純度為99%，鈣和無機磷含量分別為23.0%和17.7%。試驗所用飼糧中除鈣和磷水平不同外，其他營養(yǎng)水平均保持一致，鈣與總磷比值(鈣磷比)保持在1.2～1.4。

1.2 試驗場地和試驗期

本試驗在福建省福州市晉安區(qū)宦溪鎮(zhèn)彌高村福建彌高種豬有限公司獨棟豬場進行，試驗期從2019年10月15日至2020年1月12日，共90 d，其中預試期10 d、正試期80 d。

1.3 試驗設計和試驗動物

試驗選用640頭體重為(63.10±2.32) kg、遺傳背景一致、健康的“杜×長×大”三元雜交豬，隨機分為5個組，每組8個重復，每個重復16頭(公母各占1/2)。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，磷源為DCP；試驗1組磷源為MDCP，其中MDCP提供的磷水平為對照組DCP提供磷水平的80%；試驗2組磷源為MDCP，其中MDCP提供的磷水平為對照組DCP提供磷水平的60%；試驗3組磷源為MCP，其中MCP提供的磷水平為對照組DCP提供磷水平的80%；試驗4組磷源為MCP，其中MCP提供的磷水平為對照組DCP提供磷水平的60%。試驗設計見表1。

表1 試驗設計Table 1 Experiment design

1.4 試驗飼糧

試驗基礎(chǔ)飼糧參照《豬飼養(yǎng)標準》(NY/T 65—2004)進行配制，并根據(jù)規(guī)模養(yǎng)豬實際情況進行調(diào)整，其中鈣水平為0.55%、總磷水平為0.44%、有效磷水平為0.20%、鈣/有效磷為2.75∶1.00；試驗組飼糧根據(jù)表1所示MDCP或MCP替代DCP提供磷的比例來計算相應的調(diào)整，各組間飼糧其他營養(yǎng)水平保持一致。各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

1.5 飼養(yǎng)管理

預試期前完成免疫注射及驅(qū)蟲，隨時觀察供試豬的食欲、精神狀況和糞便等情況，發(fā)現(xiàn)異常及時將非正常豬剔除。試驗豬每天定時飼喂2次(09:00和16:00)，每次飼喂量以下次飼喂時食槽剩少許飼糧為準，自由飲水，半漏糞地面飼養(yǎng)，每天清糞1次，每周沖圈消毒1次。

1.6 樣品制備

飼糧樣品：以組為單位從每個包裝袋取飼糧150 g，混合均勻后按照四分法采集飼糧樣品，冷藏保存待測鈣和磷含量。

糞便樣品：在正試期的第78～80天，每重復連續(xù)收集全糞3 d，稱重后每重復取500 g，滴加50 mL 10%的鹽酸，置于-20 ℃凍存。將糞樣解凍，105 ℃快速烘干60 min，再65 ℃烘干至恒重，室溫下回潮24 h，粉碎過40目篩，以組為單位將3 d的糞樣混勻，按10%的比例取樣，裝入磨口瓶中-20 ℃保存，待測鈣和磷含量。

血清樣品：每個重復隨機抽取3頭豬(2公+1母)進行耳緣靜脈采血10 mL，靜置30 min后，將血液3 000 r /min離心10 min，取血清分2份裝于1.5 mL冷凍管于-20 ℃保存，待測血清鈣、磷含量及其他生化指標。

脛骨樣品：將抽血的3頭豬進行屠宰，采集前腿左右2根脛骨，去除肌肉和結(jié)締組織，測定左右脛骨的重量、長度和直徑，再將右脛骨放入-20 ℃保存以備分析脛骨強度和脛骨密度；左脛骨用乙醇脫脂48 h，再于105 ℃烘干，粉碎以備檢測鈣和磷含量。

組織樣品：豬開膛后立即用無菌手術(shù)剪刀、鑷子和剪刀采集里脊肉、肝臟組織，迅速放入液氮保存，待測胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和生長激素(GH)含量及其基因表達量。

腸道內(nèi)容物樣品：空腸、回腸和盲腸各段用滅菌麻線扎緊，將內(nèi)容物擠至一端后，開小口，再擠入凍存管中，放入液氮保存，待測腸道微生物。

1.7 測定指標及方法

生長性能指標：預試期結(jié)束時，試驗豬禁食16 h測定初始體重；試驗結(jié)束時，試驗豬禁食16 h測定終末體重，并計算平均日增重。

采用高錳酸鉀法(GB/T 6436—2002)測定鈣含量，采用磷鉬釩酸比色法(GB/T 6437—2002)測定磷含量；按照張忠遠等[8]推薦的常規(guī)全收糞法計算飼糧中鈣和磷的表觀消化率；采用DIRUI 600全自動生化分析儀測定血清鈣、磷含量及其他生化指標；采用日本島津AG-IC 20KN骨強度測定儀，對解剖剝凈的右脛骨進行骨強度測定。

血清生化指標以及組織IGF-Ⅰ和GH含量及其基因表達量委托上海恒遠生物科技有限公司測定完成。采用實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems ViiA7，ABI，美國)，設計引物為豬GH(M1095f，5′ CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA 3′；M1095r，5′ TAG CCC GCA GGT ATG TCT C 3′)和豬IGF-Ⅰ(M1096f，5′ TTC CTG AAG AGT GAA GAA TGA C 3′；M1096r，5′ GAA TGC CCA TCT TTT GAA AT 3′)，由Invitrogen合成；反應體系(20 μL)：1×定量PCR Premix 10 μL，模板cDNA 1.0 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 5 μL。反應條件：95 ℃預熱1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品重復3次，選用2-ΔΔCt定量方法[9]對GH和IGF-Ⅰ相對表達量進行分析。

按照糞便基因組提取試劑盒(Omega D4015)操作說明，提取空場、回腸和盲腸內(nèi)容物總DNA，用核酸濃度測定儀檢測其濃度和純度。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性；16S rRNA V3～V4區(qū)擴增、基因測序文庫構(gòu)建和Illumina MiSeq測序及數(shù)據(jù)生物學分析部分委托諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2010對原始數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

微生物測序數(shù)據(jù)通過使用FLASH(1.2.7)、Qiime(1.9.1)等軟件對reads進行拼接、處理得到最終的有效數(shù)據(jù)。通過Uparse(7.0.1001)軟件對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類、選取、篩選和注釋，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息并統(tǒng)計各樣本的群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷源對育肥豬生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗1組和試驗4組育肥豬終末體重顯著提高(P<0.05)，試驗1組平均日增重顯著提高(P<0.05)。

表3 不同磷源對育肥豬生長性能的影響Table 3 Effects of different phosphorus sources on growth performance of finishing pigs

2.2 不同磷源對育肥豬鈣和磷表觀消化率的影響

由表4可知，與對照組相比，各試驗組育肥豬鈣表觀消化率無顯著差異(P>0.05)，試驗2組磷表觀消化率顯著提高(P<0.05)。

表4 不同磷源對育肥豬鈣和磷表觀消化率的影響Table 4 Effects of different phosphorus sources on apparent digestibility of calcium and phosphorus of finishing pigs

2.3 不同磷源對育肥豬脛骨指標的影響

由表5可知，與對照組相比，各試驗組育肥豬脛骨鈣含量、磷含量、強度、密度、平均長度、平均重量和平均直徑均無顯著差異(P>0.05)。

表5 不同磷源對育肥豬脛骨指標的影響Table 5 Effects of different phosphorus sources on tibia indices of finishing pigs

2.4 不同磷源對育肥豬血清生化指標的影響

由表6可知，與對照組相比，試驗3組和試驗4組育肥豬血清鈣含量均顯著升高(P<0.05)，試驗1組血清磷含量顯著降低(P<0.05)；各組血清總蛋白和白蛋白含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶和肌酸激酶活性以及肌酐含量均無顯著差異(P>0.05)。

表6 不同磷源對育肥豬血清生化指標的影響Table 6 Effects of different phosphorus sources on serum biochemical indices of finishing pigs

2.5 不同磷源對育肥豬組織和血清IGF-Ⅰ和GH含量的影響

由表7可知，與對照組相比，試驗組育肥豬肌肉、肝臟和血清IGF-Ⅰ含量均顯著提高(P<0.05)，其中試驗3組和試驗4組肌肉IGF-Ⅰ含量顯著高于試驗1組和試驗2組(P<0.05)，試驗2組、試驗3組和試驗4組肝臟IGF-Ⅰ含量顯著高于試驗1組(P<0.05)，試驗3組血清IGF-Ⅰ含量顯著高于試驗1組、試驗2組和試驗4組(P<0.05)，且試驗4組血清IGF-Ⅰ含量顯著高于試驗1組(P<0.05)。

表7 不同磷源對育肥豬組織和血清IGF-Ⅰ和GH含量的影響Table 7 Effects of different phosphorus sources on contents of IGF-Ⅰ and GH in serum of finishing pigs μg/g

與對照組相比，試驗組肌肉和血清GH含量均顯著提高(P<0.05)，其中試驗3組和試驗4組肌肉GH含量顯著高于試驗1組和試驗2組(P<0.05)，試驗3組血清GH含量顯著高于試驗1組和試驗4組(P<0.05)，試驗2組和試驗4組血清GH含量顯著高于試驗1組(P<0.05)；與對照組相比，試驗2組、試驗3組和試驗4組肝臟GH含量均顯著提高(P<0.05)，其中試驗3組和試驗4組肝臟GH含量顯著高于試驗1組和試驗2組(P<0.05)，且試驗2組肝臟GH含量顯著高于試驗1組(P<0.05)。

2.6 不同磷源對育肥豬組織IGF-Ⅰ和GH相對表達量的影響

由圖1可知，與對照組相比，試驗3組育肥豬肌肉GH相對表達量顯著降低(P<0.05)；各試驗組肝臟GH相對表達量無顯著差異(P>0.05)，但試驗3組肝臟GH相對表達量顯著高于試驗1組、試驗2組和試驗4組(P<0.05)。

由圖2可知，與對照組相比，試驗2組育肥豬肌肉IGF-Ⅰ相對表達量顯著提高(P<0.05)，且顯著高于其他試驗組(P<0.05)；試驗2組肝臟IGF-Ⅰ相對表達量顯著降低(P<0.05)，但試驗3組和試驗4組肝臟IGF-Ⅰ相對表達量顯著提高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。Data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2.圖1 不同磷源對育肥豬組織GH相對表達量的影響Fig.1 Effects of different phosphorus sources on GH relative expression level in tissue of finishing pigs

圖2 不同磷源對育肥豬組織IGF-Ⅰ相對表達量的影響Fig.2 Effects of different phosphorus sources on IGF-Ⅰ relative expression level in tissue of finishing pigs

2.7 不同磷源對育肥豬腸道微生物的影響

由圖3可知，相比空腸和回腸，育肥豬盲腸微生物物種箱線圖位置較高且趨于平緩，這說明盲腸中微生物的物種較豐富，組內(nèi)樣本物種差異較小，微生物較穩(wěn)定。在空腸中，與對照組相比，試驗1組、試驗3組和試驗4組的微生物種類顯著增加，其中試驗1組最高；在回腸中，與對照組相比，各試驗組的微生物種類均顯著增加，其中試驗2組最高；而在盲腸中，各組的微生物種類差異不顯著。結(jié)果說明，不同磷源對育肥豬空腸和回腸的微生物組成有較顯著的影響。

由圖4可知，不同磷酸對育肥豬各段腸道的微生物種類和數(shù)量均有一定的影響，其中，空腸和回腸的微生物變化較明顯。與對照組相比，各試驗組空腸和回腸的微生物多樣性顯著增加。在空腸中，各試驗組的未鑒定的腸桿菌科(unidentified Enterobacteriaceae)、未鑒定的梭菌目(unidentified Clostridiales)、Terrisporobacter、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、Turicibacter、未鑒定的念珠藻目(unidentified Nostocales)屬于新增菌種；試驗2組的未鑒定的梭菌目和Terrisporobacter、試驗3組的未鑒定的腸桿菌科和放線桿菌屬以及試驗4組的紅球菌屬(Rhodococcus)相對豐度提高較高，試驗1組、試驗2組和4組的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度降低；在回腸中，各試驗組的未鑒定的腸桿菌相對豐度明顯降低，未鑒定的梭菌目、Terrisporobacter、羅姆布茨菌屬相對豐度明顯提高，紅球菌屬相對豐度急劇降低；試驗1組的鏈球菌屬和試驗4組的未鑒定的念珠藻目相對豐度提高較高。在盲腸中，各試驗組的其他(others)菌種的相對豐度占比較大，鏈球菌屬相對豐度明顯降低，Terrisporobacter和未鑒定的念珠藻目相對豐度提高。

3 討 論

夏良宙等[10]和屠焰等[11]均報道，MCP的生物學效價為高于DCP，而MDCP是MCP與DCP的絡合物，因此，理論上認為MDCP中磷的消化率應高于DCP。曹慧[12]報道，MCP和MDCP中磷的表觀消化率要高于DCP。MCP和MDCP為弱酸性，當其隨飼糧進入動物胃中時，其釋放的氫離子激活胃腸道消化酶，從而提高飼糧中磷的表觀消化率[10]。但不同的原料及其性狀、在不同動物種類的不同階段的研究報道不完全一致。早期Bertelson[13]報道，動物的生產(chǎn)性能與飼糧磷水平并不存在顯著的線性關(guān)系，不能作為評定磷相對生物學效價的指標。王秀靜[5]報道，粒狀和粉狀MDCP和MCP無機磷源的系酸力和料重比顯著低于粉狀DCP，粉狀MCP飼糧的系酸力最低，平均日增重顯著高于粉狀DCP，粉狀MCP無機磷能較好促進斷奶仔豬的生長性能。黃阿彬[14]報道，育肥豬飼糧中添加不同磷源，MCP組與DCP組的平均日采食量、料重比和平均日增重等生長性能差異不顯著。本試驗中，MDCP和MCP均為粒狀，且與對照組相比，80%MDCP組(試驗1組)和60%MCP組(試驗4組)育肥豬終末體重顯著提高，80%MDCP組平均日增重顯著提高，60%MDCP組(試驗2組)磷表觀消化率顯著提高，80%MCP組(試驗3組)和60%MCP組血清鈣、IGF-Ⅰ和GH含量顯著提高，結(jié)果表明MDCP和MCP作用效果較佳。磷的吸收受很多因素影響，主要有鈣磷比例、磷的存在形式、小腸pH、動物年齡及與其他礦物元素的互作等[15]。隨著磷的生產(chǎn)工藝的改進，粒狀能夠延長在動物腸胃停留時間，增加反應機率，特別是在當斷奶仔豬遭受斷奶應激時，胃酸分泌不足，消化酶活性降低，因此需要低系酸力的飼糧[5]。系酸力較低的MDCP、MCP能夠作用于腸胃的pH，有助于動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)的全面吸收，增強免疫力和降低腹瀉率。研究表明，鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白對腸道中磷的吸收以及腎臟中磷的重吸收等代謝過程具有非常重要的調(diào)節(jié)作用，許多試驗為對鈉離子進行測定[16]，本試驗未對鈉離子進行相關(guān)研究，這可能也是不同研究結(jié)果存在差異的原因。

J：空腸 jejunum；I：回腸 ileum；C：盲腸 cecum；CK：對照組 control group；S1：試驗1組 experimental group 1；S2：試驗2組 experimental group 2；S3：試驗3組 experimental group 3；S4：試驗4組 experimental group 4。圖4同 the same as Fig.4。圖3 不同磷源對育肥豬腸道微生物的物種累積箱線圖Fig.3 Effects of different phosphorus sources on species accumulation boxplot in intestinal microbes of finishing pigs

研究普遍認為，豬腸道磷吸收的主要位點是小腸，而大腸在磷穩(wěn)態(tài)中無顯著作用[17-19]。與DCP相比，MDCP能夠顯著提高肉雞的生長性能，提高42日齡肉雞盲腸微生物的多樣性和有益菌的數(shù)量，提高腸道的微生物穩(wěn)定性和腸道健康[2]。不同無機磷源之間的空腸總菌數(shù)量差異顯著，MDCP粒狀組的大腸桿菌數(shù)量顯著低于MCP粒狀組，且MDCP粒狀組的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量最高，MDCP和MCP均可改善斷奶仔豬腸道微生態(tài)[20]。代述均[20]研究表明，相比DCP，MDCP和MCP能夠提高肉鴨腸道絨毛高度，其中MCP粉狀組作用效果更好。本試驗獲得相似的結(jié)果，不同磷源對育肥豬各段腸道的微生物種類和數(shù)量均有一定的影響，相比空腸和回腸，盲腸微生物的物種較豐富，且組內(nèi)樣本物種差異較小?？漳c和回腸的微生物變化較明顯，且MDCP和MCP新增的菌群也不同，MDCP主要新增未鑒定的梭菌目和Terrisporobacter，而MCP主要新增未鑒定的腸桿菌科、放線桿菌屬和紅球菌屬，而盲腸微生物較穩(wěn)定。目前推測可能的原因是無機磷體外攝入后大部分存在于豬的小腸后端，即回腸中，對磷源的吸收受動物日齡、鈉離子濃度、腸道pH、飼糧含磷水平、維生素D3、三碘甲狀腺氨酸和甲狀腺氨酸等因素影響[21-22]。

Others：其他；Rhodococcus：紅球菌屬；Unidentified Nostocales：未鑒定的念珠藻目；Actinobacillus：放線桿菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Unidentified Clostridiales：未鑒定的梭菌目；Unidentified Enterobacteriaceae：未鑒定的腸桿菌科。圖4 不同磷源對育肥豬腸道微生物在屬水平上的影響Fig.4 Effects of different phosphorus sources on intestinal microbes of finishing pigs at genus level

4 結(jié) 論

飼糧選用MDCP或MCP替代DCP來補充磷源，以MDCP或MCP提供的磷水平為DCP提供磷水平的80%或60%為替代比例，對育肥豬脛骨指標和大部分血清生化指標無顯著影響，在一定程度上能夠提高育肥豬的生長性能，增加腸道微生物的多樣性，是替代DCP的良好磷源。