王海亮 張文舉 牛俊麗 聶存喜

(石河子大學動物科技學院，石河子 832000)

現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖中抗生素的不合理使用，導致了病原菌耐藥性、畜產(chǎn)品藥物殘留、畜禽機體免疫力低下與雙重感染和環(huán)境污染等諸多問題[1]。目前，我國飼料中全面禁止添加抗生素，因而抗生素的替代越來越受到廣大研究者的關注，其中通過細菌群體感應(quorum sensing，QS)實現(xiàn)腸道健康來替代抗生素是一種新的方法。QS是細菌用來調(diào)節(jié)集體行為的細胞間交流過程，它依賴于細菌群體密度而調(diào)控其生理行為[2]。細菌在生長過程中會分泌化學信號分子，伴隨細菌的分裂生長和群體密度的增加，胞外信號分子濃度也隨之增加，細菌會通過胞外信號分子的濃度而感知其群體密度。當胞外信號分子濃度達到某一閾值時，細菌會啟動一系列基因的表達，從而調(diào)節(jié)細菌群體行為，致使宿主產(chǎn)生正面或負面應答。腸道作為宿主微生物的聚集地和營養(yǎng)素的主要吸收器官，它的生理狀態(tài)直接影響宿主健康。QS可通過微生物的信息交流調(diào)控腸道屏障功能與營養(yǎng)素代謝，進而維持機體對營養(yǎng)素的吸收和腸道健康[3]。因此，研究QS及群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitor，QSI)和QS介導腸道菌群促進機體健康發(fā)生機制對于動物健康養(yǎng)殖具有重要意義。

1 QS系統(tǒng)

科學家們研究費氏弧菌(Vibriofischeri)的發(fā)光機理時發(fā)現(xiàn)其釋放信息交流信號，此信號分子調(diào)控自身發(fā)光，是一種依賴于菌群密度系統(tǒng)而發(fā)生的生理行為，即QS系統(tǒng)。QS不僅能夠調(diào)節(jié)細菌生物發(fā)光，還可以調(diào)節(jié)細菌色素合成、生物膜形成、致病性、抗生素的分泌[4-5]。同時，QS在調(diào)節(jié)細菌共生、細菌素的產(chǎn)生、遺傳能力、細胞的程序性死亡等方面也具有重要作用[6-8]。多種信號分子介導細菌之間的信息交流，根據(jù)信號分子的種類和感應信號分子的作用機制將細菌QS系統(tǒng)分為以下幾類：1)由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-L-homoserine lactones，AHLs)介導的自體誘導物分子1型(auto-inducer-1，AI-1)QS系統(tǒng)，是革蘭氏陰性菌中常見的QS系統(tǒng)；2)由寡肽(autoinducing peptides，AIPs)介導的QS系統(tǒng)，是革蘭氏陽性菌中常見的QS系統(tǒng)；3)由呋喃硼酸二酯類介導的自體誘導物分子2型(autoinducer-2，AI-2)QS系統(tǒng)，是細菌種間(內(nèi))信息交流的QS系統(tǒng)；4)除了以上3種主要的細菌QS系統(tǒng)外，還有自動誘導型信號分子，擴散信號因子等介導的QS系統(tǒng)。

1.1 以AHLs為代表的革蘭氏陰性細菌QS系統(tǒng)

研究表明，革蘭氏陰性細菌QS系統(tǒng)的信號分子主要為?；呓z氨酸內(nèi)酯類[9]。AHLs常作為自體誘導物介導革蘭氏陰性細菌AI-1型QS的發(fā)生，此系統(tǒng)的發(fā)生過程為LuxI酶合成AHL，后者可以通過細胞膜自由擴散；在達到閾值濃度時，AHLs與其受體LuxR結合；該受體的二聚作用使LuxR能夠在Lux盒上作為一個轉錄因子，進而觸發(fā)參與細菌毒力的靶基因和AHLs系統(tǒng)LuxI/LuxR的表達(圖1)。

圖1 革蘭氏陰性細菌中群體感應發(fā)生機制Fig.1 Mechanism of quorum sensing in Gram negative bacteria[10]

1.2 以AIPs為代表的革蘭氏陽性細菌QS系統(tǒng)

AIPs是革蘭氏陽性細菌QS系統(tǒng)信息交流的主要信號分子，這些寡肽類分子不能自由透過細菌的細胞壁，需要一種通道蛋白或者一種名為ABC(ATP-binding-cassette)的轉運系統(tǒng)幫助，此系統(tǒng)可以把AIPs轉運出細胞從而發(fā)揮作用[11]。革蘭氏陽性細菌QS發(fā)生信號轉導系統(tǒng)感應AIPs信號由自動誘導肽由AIPs合成酶產(chǎn)生，其中單組分信號轉導系統(tǒng)通過轉運體釋放到細胞外基質中進行AIPs修飾，被修飾后的AIPs轉運回細胞質與受體結合發(fā)揮QS調(diào)控作用。然而，雙組分信號轉導系統(tǒng)轉運體對產(chǎn)生的自動誘導肽進行翻譯和修飾后將其釋放到細胞外基質中，通過跨膜受體對其識別后，觸發(fā)QS相關應答調(diào)節(jié)子基因的轉錄，從而發(fā)揮調(diào)控功能(圖2)。

1.3 以AI-2為代表的細菌種間(內(nèi))QS系統(tǒng)

AI-2是革蘭氏陽性細菌和陰性細菌共用的QS信號分子，AI-2型QS系統(tǒng)是由呋喃硼酸二酯類信號分子介導，幾百種細菌都存在此系統(tǒng)[13]。由于AI-2型QS系統(tǒng)可以介導細菌在種間進行信息交流，因此，可以把它稱為細菌之間的“共用語言系統(tǒng)”。在AI-2型QS系統(tǒng)中，進行調(diào)控的關鍵基因是LuxS，它參與了AI-2信號分子的合成。AI-2的合成取決于LuxS編碼的合成酶，是一種將核糖基高半胱氨酸轉化為高半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮的代謝酶，對于沒有AI-2合成蛋白或受體蛋白的細菌，AI-2用于種內(nèi)/種間通訊，包括參與信號轉導和調(diào)控其他微生物的下游基因表達(圖3)。

2 QS淬滅機制以及抑制劑

有害菌QS活動可給宿主動物帶來不利影響，目前主要利用QSI進行淬滅以阻斷QS發(fā)生來消除其帶來的不利影響。QSI主要包括植物來源和微生物來源。

2.1 QSI淬滅機制

QSI主要通過以下4個方面來阻斷QS發(fā)生：1)抑制有害菌QS系統(tǒng)中信號分子的合成；2)降解已合成的QS信號分子，使信號分子的濃度達不到調(diào)控閾值；3)干擾QS信號分子與對應受體蛋白結合；4)抑制參與信號轉導的小分子，阻斷QS的完整性。

2.2 QSI的種類及其作用效果

目前，對QS有抑制作用的分子有如下幾類，詳情請見表1。

表1 QSI的種類、作用途徑及效果Table 1 Types, action pathways and effects of quorum sensing inhibitors

續(xù)表1種類Types作用對象及途徑Target and approach效果Effect參考文獻Reference有機磷Organophosphate群體感應干擾腸道微生物群的發(fā)展軌跡和群體感應如運動性和致病性Zhou等[18]肽類Peptides金黃色葡萄球菌Agr群體感應拮抗劑、可阻止自誘導肽與副基因調(diào)節(jié)器C型操縱子(AIP-AgrC)信號相互作用Karathanasi等[19]糖及核苷Sugars and nucleosides生物膜、群體感應通過靶向AI-2活性用于預防牙周病病原體的生物膜形成;核苷分解代謝與果蠅腸道中的群體感應相關,觸發(fā)了果蠅腸道細菌間通訊和發(fā)病機制Ryu等[20]Kim等[21]有機酸Organic acid嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和沙門氏菌、群體感應顯著降低報告菌紫色素產(chǎn)量、血液溶血活性和群集運動及生物膜的生成量;顯著抑制生物膜的形成、聚集能力以及蛋白酶和彈性酶活性、鼠李糖脂等毒力因子的產(chǎn)生;可減少大腸桿菌和沙門氏菌有害菌生物膜的生成Patel等[22]Wang等[23]Amrutha等[24]酚類Phenols銅綠假單胞菌、群體感應以劑量依賴的方式抑制有害菌泳動和群集運動性Mostafa等[25]萜類Terpenoids銅綠假單胞菌、生物膜、群體感應破壞銅綠假單胞菌生物膜的生成和胞外多糖的產(chǎn)生Rasamiravaka等[26]醛類Aldehydes銅綠假單胞菌、群體感應降低了銅綠假單胞菌運動性和毒力因子綠膿菌素等的產(chǎn)生Heidari等[27]醇類Alcohols白色念珠菌、群體感應可降低白色念珠菌的毒力,甚至使其凋亡Riekhof等[28]黃酮類Flavonoids銅綠假單胞菌、生物膜、群體感應顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜形成和毒力因子的表達Ouyang等[29]酯類Esters哈氏弧菌、大腸桿菌JB525、群體感應抑制哈氏弧菌生物發(fā)光和抑制大腸桿菌JB525產(chǎn)生綠色熒光蛋白Forschner-dancaus等[30]

2.2.1 植物來源QSI

有研究報道，從17種中草藥中篩選得到了蒲公英、連翹、獨活、杜仲、板藍根、白癬皮、白芷、馬齒莧8種有效QSI，13種中草藥粗提取物明顯抑制銅綠假單胞菌的浮游遷移活動[31]。趙弘毅[32]研究表明，丁香、赤芍等中草藥粗提取物具有良好的抑菌效果，部分中草藥如何首烏、八角茴香、菊花等可通過干預信號分子與受體蛋白的結合來實現(xiàn)對細菌QS調(diào)控。冬凌草片中冬凌草甲素對銅綠假單胞菌毒力因子的產(chǎn)生有類似效果[33]，決明子提取產(chǎn)物對銅綠假單胞菌PAO1的毒力因子和生物膜也有顯著的抑制作用[34]。

a:單組分QS系統(tǒng)one-component QS system；b: 2組分QS系統(tǒng) two-component QS system; SAH: Pfs：DPD:AI-2:自體誘導物分子2型autoinducer-2。圖2 革蘭氏陽性細菌中群體感應發(fā)生機制Fig.2 Mechanism of quorum sensing in Gram positive bacteria[12]

a:有無LuxS的AI-2合成路線 AI-2 synthetic routes with or without LuxS；b:AI-2的種內(nèi)/種間通訊 AI-2 intraspecific/interspecific communication; IM: 內(nèi)膜intima; OM:外膜 outer membrane；SAH：S-腺苷高半胱氨酸 S-adeno-sylhomocysteine；Pfs：S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶 S-adenosylhomocysteine nucleosidase；SRH：S-核糖高半胱氨酸 S-ribosylhomocysteine；DPD：4,5-二羥基2,3-戊二酮 4,5-di-hydroxy 2,3-pentanedione；AI-2：自體誘導物分子2型 autoinducer-2。圖3 細菌中的AI-2合成和感知Fig.3 AI-2 synthesis and perception in bacteria[14]

除中草藥外，植物精油和植物提取物也具有抑制QS的作用。植物精油中的化合物香芹酚能顯著抑制熒光假單胞菌的生物膜形成[35]，綠薄荷精油和阿魏精油可作為與食品有關微生物和QSI[36-37]。在植物提取物方面，牡丹花中的酚類成分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生物膜抑制率達到87.03%和77.93%[38]；大蒜提取物對紫色桿菌CVO26(ChromobacteriumviolaceumCVO26)QS有一定的抑制作用[39]；芒果提取物和番石榴中的黃酮可抑制銅綠假單胞菌PAO1的毒力因子表達和生物膜形成[40-41]；連翹提取物和花椒提取物分別抑制銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌QS發(fā)生[42-43]。此外，花椒提取物可通過降低嗜水氣單胞菌AHLs的分泌，有效抑制其生物膜的形成和胞外蛋白酶活性。Lee等[44]研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花提取物對大腸桿菌O157∶H7 QS和體內(nèi)毒力有抑制作用。金銀花中的重要成分之一綠原酸可在不影響熒光假單胞菌正常生長的情況下，明顯抑制胞外蛋白酶、胞外脂肪酶活性、群集與泳動等相關腐敗特性[45]。洋蔥皮中的乙酸乙酯餾分(ONE)，能顯著抑制由QS介導毒力因子的產(chǎn)生，如紫色桿菌素、彈性蛋白酶[46]。余甘子多糖具有抑菌活性及QSI活性，當其終濃度為20 mg/mL時對紫色桿菌素生成量的抑制作用最大[47]。郭勛[48]研究證實，穿心蓮中主要的活性成分穿心蓮內(nèi)酯能顯著降低引起雞敗血癥、氣囊炎、輸卵管炎的致病性大腸桿菌-O78中AI-2的分泌。從牛至、百里香等植物中提取的百里香酚能介導QS來調(diào)控動物腸道菌群[49]。由上述可見，植物相關來源的物質在QS發(fā)生上有較好的作用效果和應用前景。

2.2.2 微生物來源QSI

益生菌在畜禽胃腸道中可搶占某些細菌和真菌的生存空間和資源，競爭性抑制QS活性和生物膜的形成。如林洋等[50]從發(fā)酵酸豆角中分離得到了能抑制嗜水氣單胞菌群體感應和生物膜形成的植物乳桿菌AJS2-4。嗜酸菌La-5可分泌一種QS信號抑制分子，直接與細菌轉錄調(diào)控因子相互作用，控制參與定植的腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157∶H7毒力基因的轉錄[51]。Kim等[52]在斷奶仔豬的研究中，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌30SC細胞提取物可顯著抑制EHECO157∶H7中AI-2活性。此外，乳桿菌也能夠通過抑制QS活性抑制有害菌生物膜的形成。Melian等[53]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌素AL705能通過QS機制抑制李斯特菌生物膜的形成?？莶菅挎邨U菌分泌的枯草桿菌素能有效抑制大腸桿菌、李斯特菌生物膜的形成[54]，芽孢桿菌分泌的芽孢桿菌脂肽可以通過抑制金黃色葡萄球菌QS來消除其在人體內(nèi)定植[55]?？莶菅挎邨U菌作為一種畜禽常用益生菌，在與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)表明，其可以顯著減少嗜水氣單胞菌毒力因子的分泌[56]。因此，益生素介導QS對于維持動物腸道健康具有重要作用。

3 QS介導的腸道健康

腸道中存在著大量且復雜的微生物，這些微生物菌群對宿主養(yǎng)分消化、吸收、能量供應和維持正常生理和免疫功能等具有重要意義。

3.1 QS與腸道交流機制

在腸道上百萬個微生物中，細菌的占比超過了99%[57]，腸道中的微生物被形象的稱作動物體內(nèi)移動的器官，也可作為一種生物屏障保護腸道健康[58]。在哺乳動物腸道中，通過抗生素處理可改變腸道微生物組成，進而引起AI-2水平變化，細菌感應AI-2產(chǎn)生白細胞介素-8(IL-8)、腎上腺素和去甲腎上腺素和AI-2模擬物來影響生物膜的形成(圖4)。

圖4 哺乳動物腸道中AI-2介導的群體感應Fig.4 AI-2-mediated quorum sensing in mammalian gut[59]

3.2 QS介導的腸道健康

QS可作為橋梁來介導腸道、營養(yǎng)素和一些代謝物促進腸道健康，如QS介導的葡聚糖、果聚糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、果膠、淀粉、母乳和多酚的低聚物等益生元在促進胃腸道健康方面起到了積極作用[60]。研究表明，0.1%和0.5%的葡萄糖顯著下調(diào)QS中LuxS系統(tǒng)影響的大腸桿菌O157∶H7的毒力基因Lee的表達量[61]，濃度超過0.05%的葡萄糖顯著抑制嗜水氣單胞菌QS活性、生物膜形成、蛋白酶產(chǎn)生以及群集和泳動[62]。腸道微生物在宿主屏障功能、氨基酸等養(yǎng)分代謝方面具有重要作用[63]。有研究表明，QS信號分子(3OC12-HSL)可通過腸道屏障功能和氨基酸代謝影響低出生體重仔豬健康[3]。在以仔豬小腸上皮細胞IPEC-J2為模型的研究中發(fā)現(xiàn)，不同來源QS信號分子刺激對宿主細胞相關基因表達產(chǎn)生顯著影響[64]。有研究報道，賴氨酸、色氨酸顯示出抗QS和顯著的抗生物膜活性[65-66]，限制碳源會抑制QS系統(tǒng)的激活[67]。乳酸鹽和丙酮酸鹽可增強小鼠機體免疫反應，對腸道沙門氏菌感染具有抵抗性[68]；丁酸鹽可減少沙門氏菌等有害菌的定植和引起的腹瀉[69]。乳酸對銅綠假單胞菌QS信號分子、彈性蛋白酶、蛋白酶、吡氰素的產(chǎn)生和生物膜的形成具有抑制作用[70]，醋酸鹽可通過QS激活乳酸菌對細菌素的合成[71]。

一種來源于藏靈菇發(fā)酵奶的馬克斯克魯維酵母菌代謝產(chǎn)物乙酸色醇，可阻斷革蘭氏陰性菌的QS，干擾腸道霍亂弧菌的CAI-1 QS級聯(lián)，進而顯著改變其生物膜的形成和形態(tài)，降低細菌毒力[72]。Kim等[73]利用大腸桿菌和沙門氏菌成功證實，小鼠腸道內(nèi)微生物菌群種內(nèi)和種間基于QS的信號傳遞，表明細菌QS與腸道健康有密不可分的關系。在抗生素治療引起的小鼠腸道微生物群失衡的情況下，大腸桿菌會增加腸道AI-2水平，進而影響微生物菌群的組成改變，改善機體腸道健康[74]。銅綠假單胞菌QS轉錄因子MvfR(PqsR)控制著多種毒力因子的表達和有毒產(chǎn)物的合成。Adiliaghdam等[75]研究表明，抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)可通過維持腸道屏障和免疫功能來緩解腸道通透性過高，減少細菌耐藥性的發(fā)展，并保留有益的腸道微生物。腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)具有多重抗感染、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，對腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起決定性作用，其會通過基于QS的代謝和免疫機制來抵抗腸道病原體，從而保護宿主健康[76]。產(chǎn)氣莢膜梭菌C型可導致人和動物產(chǎn)生腸毒血癥和出血性腹瀉等嚴重疾病。Nava等[77]研究發(fā)現(xiàn)，用產(chǎn)氣莢膜梭菌C型菌株CN3685感染人腸道細胞后，由QS調(diào)控的產(chǎn)氣莢膜梭菌Agr樣(clostridium perfringens Agr-like，CpAL)系統(tǒng)介導的用于評估腸道屏障功能的腸道細胞跨上皮抵抗力(trans-epithelial resistance，TEER)顯著下降。對金魚腸道細菌基因序列鑒定和產(chǎn)生AHL能力篩選中發(fā)現(xiàn)，當AHLs濃度達到一定閾值時，氣單胞菌和希瓦氏菌屬細菌可通過QS系統(tǒng)相互交流[78]。Tao等[79]研究發(fā)現(xiàn)，腸道中革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的AHLs群體感應分子可以影響腸上皮穩(wěn)態(tài)。N-3-(氧十二烷?；?-高絲氨酸內(nèi)酯(C12-HSL)會通過誘導線粒體功能障礙和激活細胞凋亡顯著降低細胞活力，導致黏蛋白表達降低。QS分子酰基高絲氨酸內(nèi)酯，被認為能調(diào)節(jié)腸出血性大腸桿菌的基因表達，從而幫助該病原體在動物胃腸道中存活。從豬腸道中分離的嗜水氣單胞菌菌株YZ2研究發(fā)現(xiàn)，其能產(chǎn)生N-丁?；呓z氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)，用質譜分析該菌與大腸桿菌共培養(yǎng)的上清液顯示，該菌的LuxI同系物可以使大腸桿菌具有合成AHLs的能力，并影響大腸桿菌的運動性和耐酸性[80]。此外，乳酸菌的AI-2群體信號傳遞可能是適應宿主生態(tài)系統(tǒng)和在腸道環(huán)境中相互作用的一種方式[81]。QS信號分子AI-2可通過耐藥基因tetA調(diào)控禽致病大腸桿菌金霉素耐藥性，對于治療耐藥型禽致病大腸桿菌提供了新的藥物靶標與治療思路[82]。

Ismail等[83]發(fā)現(xiàn)，哺乳動物腸道中產(chǎn)生的AI-2類似物可以激活其腸道中細菌的QS系統(tǒng)，這種類似物可以被細菌AI-2受體LuxP/LsrB檢測到，從而激活系統(tǒng)控制相關基因的表達。腸道黏膜可以通過降解細菌自體誘導物AIs或分泌AI模擬物來干擾細菌AIs，從而實現(xiàn)腸道微生物群與宿主之間的域間信號傳遞，這為未來腸道微生物群相關疾病的治療提供了新的靶點[84]。由此可見，群體感應與腸道健康關系密切，如果能抑制有害菌的QS活動，對于促進畜禽機體健康，提高其生產(chǎn)性能具有重要意義。

4 小結與展望

目前，對于細菌QS的相關研究主要關注QS與有害菌之間的關系，而QS介導的腸道與營養(yǎng)素及微生物代謝物之間和有益菌的作用研究較少，多是一些表征性的因果關系，缺乏QS調(diào)控畜禽腸道微生物活動相關機制的闡述。腸道是一個非常復雜的消化器官，通過蛋白組學、代謝組學、微生物組學等多組學技術解析QS介導有益菌和有害菌定植與代謝、營養(yǎng)素與宿主代謝將會是研究的重要方向，對于以QS為靶標的促進畜禽腸道健康替抗產(chǎn)品開發(fā)也具有廣闊的前景。