劉宏瑀，宋艷麗，王可心，高玉萌，高小麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院；旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100)

小粒黑豆是黃土高原地區(qū)主栽的黑色大豆品種之一，尤以陜北等地栽培較多，因具有極強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，其在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]。小粒黑豆既含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和其他礦質(zhì)元素，又含有黃酮、酚類(lèi)物質(zhì)、花色苷等生物活性成分[2, 3]，可開(kāi)發(fā)成多種食藥兼用型產(chǎn)品[4, 5]。

在食品加工領(lǐng)域中，萌發(fā)處理是用來(lái)改善種子品質(zhì)的一種重要方法。萌發(fā)作為一種經(jīng)濟(jì)有效的加工方式，能夠迅速打破大豆種子的休眠狀態(tài)，激活其內(nèi)源酶[6, 7]和各種代謝通路[8]，提高種子中活性成分的含量，從而改善其營(yíng)養(yǎng)保健功能。同時(shí)，萌芽處理還能有效降低大豆中脂肪酸氧化酶、植酸、植物凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量, 提高其食用價(jià)值[9]。酚類(lèi)是芳香烴環(huán)上連接1個(gè)或多個(gè)羥基的化合物,其有助于提高植物性食物整體的抗氧化性,是極佳的營(yíng)養(yǎng)保健活性成分[10]。發(fā)芽可顯著提高豆類(lèi)的酚類(lèi)物質(zhì)含量，且在發(fā)芽后期出現(xiàn)最大值[11,12]。Aguilera等[13]研究表明，綠豆和扁豆發(fā)芽后總酚類(lèi)物質(zhì)增加，抗氧化活性增強(qiáng)。大豆中的黃酮類(lèi)物質(zhì)是天然的有效活性成分，其具有抗氧化、提高機(jī)體免疫功能和調(diào)節(jié)血脂血壓等作用[14]。未經(jīng)處理的大豆異黃酮含量極低，經(jīng)萌芽處理后，異黃酮含量顯著增加[15]。李振艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽48 h的大豆異黃酮含量相比于未發(fā)芽的干大豆上升了92.1%。王莘等[17]發(fā)現(xiàn)不同豆類(lèi)的活性物質(zhì)含量達(dá)到最大值的萌發(fā)時(shí)間不同，大豆、綠豆和黑豆的異黃酮在萌發(fā)40、39、54 h時(shí)達(dá)最大值，皂苷則在萌發(fā)20、39、54 h時(shí)達(dá)最大值。羅旭等[18]發(fā)現(xiàn)4種大豆抗氧化能力與總多酚、總黃酮、異黃酮含量顯著相關(guān)，曾慶真等[19]利用DPPH和ORAC法測(cè)定大豆萌發(fā)過(guò)程中芽、莖和子葉的抗氧化活性，也得出了相同的結(jié)論。由此可見(jiàn)，萌芽可作為提高豆類(lèi)活性成分含量和改善豆類(lèi)抗氧化功能的重要手段之一，研究萌發(fā)對(duì)小粒黑豆活性組分及抗氧化能力的影響對(duì)其開(kāi)發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

目前關(guān)于萌發(fā)對(duì)小粒黑豆功能特性的影響研究鮮有報(bào)道，本研究探討小粒黑豆萌芽過(guò)程中活性組分及抗氧化能力的變化規(guī)律，旨在揭示小粒黑豆萌芽期間的功能特性，為小粒黑豆芽菜生產(chǎn)及多元化開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以黃土高原“神木連枷條”、“定邊小黑豆”和“子洲小黑豆”品種為實(shí)驗(yàn)材料，分別簡(jiǎn)稱(chēng)SM、DB和ZZ。

1.2 發(fā)芽小粒黑豆樣品的制備

挑選籽粒飽滿(mǎn)且無(wú)病害的不同品種小粒黑豆種子各300 g左右，3次重復(fù)。首先用蒸餾水沖洗表面的雜質(zhì)和懸浮癟粒，然后取適量蒸餾水浸泡3 h。浸泡結(jié)束后，再用蒸餾水沖洗除去豆子表面黏性雜質(zhì)。將浸泡后的小粒黑豆表面的水分瀝干后，放入發(fā)芽機(jī)中，均勻攤開(kāi)鋪平，并用遮光布進(jìn)行遮光，發(fā)芽溫度控制在23～28 ℃左右。發(fā)芽過(guò)程中，每隔2 d進(jìn)行沖洗并換水。每隔1 d取樣，樣品冷凍干燥后，粉碎、過(guò)篩、脫脂后測(cè)定活性成分和相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 提取液的制備

參考Prior等[20]和Korus等[21]方法制備提取液，并稍作修改。稱(chēng)取2 g脫脂后小粒黑豆粉，在25 ℃下用25 mL 70%丙酮以150次/min的振蕩頻率提取3 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。殘留物在25 ℃下用25 mL 70%丙酮再次振蕩提取3 h，4 000 r/min離心10 min，然后合并提取液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 活性組分含量的測(cè)定

1.3.2.1 總酚含量的測(cè)定

參照Xu[22]的方法，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法測(cè)定，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以A765值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品中的總酚含量以沒(méi)食子酸計(jì)。沒(méi)食子酸濃度與A765值之間具有極顯著的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性關(guān)系為y=71.196x+0.025，決定系數(shù)R2=0.995 9。

1.3.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

參照J(rèn)ia等[23]的方法，用蘆丁制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以A510值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品中的總黃酮含量以蘆丁計(jì)。蘆丁濃度與A510值之間具有極顯著的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性關(guān)系為y=10.401x-0.065 9，決定系數(shù)R2=0.992 5。

1.3.2.3 總花色苷含量的測(cè)定

參照J(rèn)eng等[24]的方法，采用pH示差法測(cè)定，樣品中的總花色苷含量以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷計(jì)。

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

參照Xu[22]的方法，將方法中的無(wú)水甲醇換成無(wú)水乙醇。

1.3.3.2 O2-·清除能力的測(cè)定

參照Beauchamp等[25]方法。

1.3.3.3 ·OH清除能力的測(cè)定

參照Li等[26]的方法。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性分析，Origion 2021進(jìn)行繪圖，SPSS 25.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)對(duì)小粒黑豆活性組分的影響

2.1.1 總酚含量的變化

植物多酚類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物，是天然的抗氧化劑。由圖1可知，SM和ZZ各發(fā)芽時(shí)期的總酚含量差異顯著，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，SM、DB和ZZ總酚含量均呈持續(xù)升高的趨勢(shì)。3種小粒黑豆均在芽菜生長(zhǎng)的第5天總酚含量達(dá)到最高值，分別為9.93、12.21、15.72 mg/g，相比發(fā)芽第1天依次上升了70.62%、58.78%、151.12%，可見(jiàn)發(fā)芽有利于小粒黑豆中多酚的累積，其中ZZ對(duì)多酚的積累效果最為明顯。有研究發(fā)現(xiàn)大豆總多酚含量隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)上升趨勢(shì)[27]，秦高一鑫等[28]在豌豆中也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，這與本研究結(jié)果一致，可能是豆粒在萌芽過(guò)程中，受到外界環(huán)境因子的影響以及自身結(jié)構(gòu)的改變，內(nèi)源酶作用植物組織合成具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，使多酚含量顯著提高。

圖1 萌發(fā)過(guò)程中豆芽總酚含量

2.1.2 總黃酮含量的變化

目前，關(guān)于豆類(lèi)中黃酮含量的研究較少，大多是關(guān)于異黃酮的研究[29, 30]。黃酮類(lèi)化合物是小粒黑豆中的主要活性物質(zhì)之一。由圖2可以看出，小粒黑豆的總黃酮含量隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，基本上呈現(xiàn)先升高后降低的單峰變化趨勢(shì)。SM和ZZ在萌發(fā)第3天時(shí)總黃酮含量最高，分別為3.58、5.63 mg/g，相比于萌發(fā)第1天分別上升了17.38%和86.42%，ZZ在萌發(fā)第3天時(shí)總黃酮含量急劇上升，為第2天的1.72倍。DB的總黃酮含量在萌發(fā)第2天和第3天差異并不顯著，其在萌發(fā)第4天時(shí)達(dá)到峰值，為3.26 mg/g。本研究結(jié)果與張桂芳等[31]的研究結(jié)果一致，這可能是由于大量生物酶在萌發(fā)前期被激活，刺激了種子中活性物質(zhì)的釋放，但隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，在酶催化作用下形成的黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無(wú)法與Al3+形成穩(wěn)定的鋁絡(luò)合物，從而引起測(cè)定的總黃酮含量降低。

圖2 萌發(fā)過(guò)程中豆芽總黃酮含量

2.1.3 總花色苷含量的變化

花色苷是重要的抗氧化活性物質(zhì)，能夠與自由基反應(yīng)清除自由基從而消除氧化作用。由圖3可以看出，小粒黑豆在萌發(fā)后1～5 d內(nèi)，其總花色苷含量呈現(xiàn)明顯的單峰變化趨勢(shì)，花色苷含量在發(fā)芽前期增長(zhǎng)較快，SM、DB和ZZ在萌發(fā)第1、2、3 天時(shí)的總花色苷含量均存在顯著差異。SM、DB和ZZ分別在萌發(fā)第3、4、3天達(dá)到最高值，依次為19.41、15.86、24.64 mg/g，分別是萌發(fā)第1天的1.95、3.10、11.79倍，ZZ對(duì)花色苷的富集作用最為顯著。

圖3 萌發(fā)過(guò)程中豆芽總花色苷含量

2.2 萌發(fā)對(duì)小粒黑豆抗氧化能力的影響

2.2.1 DPPH·清除能力的變化

豆類(lèi)萌發(fā)過(guò)程中，籽粒中儲(chǔ)藏的物質(zhì)發(fā)生分解，合成新的化合物，這一生理生化特征發(fā)生顯著變化的活躍過(guò)程會(huì)促使多酚、黃酮、GABA等活性物質(zhì)含量急劇上升，并且隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH·清除等抗氧化能力增強(qiáng)[32, 33]。由圖4可以看出，在發(fā)芽第1天，3種小粒黑豆的DPPH·清除能力均在30%左右。隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，SM、DB和ZZ的 DPPH·清除能力呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。SM在萌發(fā)的第2天出現(xiàn)凹谷現(xiàn)象，其第2天的DPPH·清除能力為28.63%；DB呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第3天達(dá)到最大值44.96%；ZZ則呈持續(xù)升高的變化趨勢(shì)，在第5天達(dá)到峰值，為49.74%，相較萌發(fā)第1天上升了58.86%。

圖4 萌發(fā)過(guò)程中豆芽清除DPPH·能力

2.2.2 O2-·清除能力的影響

由圖5可以看出，不同品種小粒黑豆在萌發(fā)的1～5 d內(nèi)，O2-·的清除能力基本呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)，均在芽菜生長(zhǎng)的第5天達(dá)到最大值，SM，DB和ZZ最大清除率分別為54.54%、43.77%和44.71%，依次是萌發(fā)第1天的1.83、1.53、1.93倍，可見(jiàn)萌發(fā)能夠有效提高小粒黑豆的O2-·清除能力。

圖5 萌發(fā)過(guò)程中豆芽清除O2-·能力

2.2.3 ·OH清除能力的變化

由圖6可以看出，不同品種小粒黑豆萌發(fā)過(guò)程中·OH清除能力不同，在萌發(fā)第1天，3種小粒黑豆的·OH清除能力在57%～62%之間。隨著萌發(fā)天數(shù)的增加，DB和ZZ的·OH清除能力呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在萌發(fā)的第2、4天達(dá)到峰值，峰值依次為70.50%和60.54%；SM的·OH清除能力呈“波浪形”，先增強(qiáng)后減弱，在第3天出現(xiàn)最低值54.05%，之后再增強(qiáng)，并在第5天達(dá)到峰值68.68%。不同品種小粒黑豆在萌發(fā)過(guò)程中·OH清除作用變化趨勢(shì)不同，如SM在萌發(fā)過(guò)程中，隨著萌發(fā)天數(shù)增加，·OH清除能力表現(xiàn)出先升高后降低，然后再升高兩個(gè)極值的現(xiàn)象，這與魏美霞等[34]、郭鴿等[35]在綠豆和大豆上的研究結(jié)果相似，但DB和ZZ與此結(jié)果不完全一致，可能是由于品種特性和遺傳因素不同，在萌發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生了其他影響自由基清除作用的物質(zhì)，具體原因有待進(jìn)一步探索。

圖6 萌發(fā)過(guò)程中豆芽清除·OH能力

2.3 萌發(fā)過(guò)程中小粒黑豆活性組分與抗氧化能力的相關(guān)性分析

對(duì)小粒黑豆總酚、總黃酮、總花色苷、DPPH·清除能力、O2-·清除能力和·OH清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。ZZ的DPPH·清除能力與總酚含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，DB的DPPH·清除能力與總黃酮和花色苷含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，SM和ZZ的O2-·清除能力和總酚含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3種小粒黑豆抗氧化能力大小與總酚、總黃酮、總花色苷中某一成分含量高低有關(guān)。不同品種之間黃酮、總酚及花色苷含量與抗氧化性能力的相關(guān)性存在一定的差異，這可能與品種特性和遺傳因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探索。

表1 抗氧化能力與活性組分含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

萌發(fā)能夠顯著提高小粒黑豆活性物質(zhì)含量和抗氧化能力。參試的3種小粒黑豆在萌芽過(guò)程中，總酚含量、花色苷含量均呈不斷上升趨勢(shì)，O2-·清除能力的增強(qiáng)效果最為顯著。“子州小黑豆”出現(xiàn)峰值時(shí)的總黃酮、總酚和花色苷含量均顯著高于其他兩個(gè)品種。相關(guān)性分析表明，“子洲小黑豆”的DPPH·清除能力和O2-·清除能力與總酚含量分別呈極顯著正相關(guān)和顯著正相關(guān)關(guān)系。相對(duì)而言，“子洲小黑豆”更具有開(kāi)發(fā)功能性產(chǎn)品的潛力。萌發(fā)處理可作為一種提高小粒黑豆及其制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物利用率的有效方法，但不同品種以及萌發(fā)時(shí)間都會(huì)對(duì)產(chǎn)品的活性組分及抗氧化能力產(chǎn)生一定的影響，因此，生產(chǎn)上可根據(jù)產(chǎn)品加工對(duì)各功能成分的需求選擇優(yōu)質(zhì)專(zhuān)用品種，并確定適宜的萌發(fā)時(shí)間。