蘇迎利, 馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

阿月渾子(PistaciaveraL.)為漆樹科黃連木屬的落葉小喬木，是我國珍貴的木本油料植物，其堅果商品名為開心果，為世界五大堅果之一[1]。阿月渾子堅果仁營養(yǎng)豐富，尤其富含油脂，每100 g阿月渾子堅果仁脂肪可達(dá)到53 g，占到阿月渾子堅果仁質(zhì)量的一半以上，故其易感染黃曲霉產(chǎn)生AFB1[2]，國標(biāo)規(guī)定堅果及籽類中除花生之外其他的熟制堅果及籽類的限量標(biāo)準(zhǔn)為5.0 μg/kg[3]，并有即將實施的國標(biāo)規(guī)定阿月渾子中黃曲霉毒素污染控制規(guī)范[4]，使阿月渾子被AFB1感染的幾率降低。

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一種次生代謝物，具有急慢性毒性、致畸、致癌和致突變性[5]。黃曲霉毒素可存在于各種富含油脂的食品中，如堅果、谷物和香料中[6]。目前降解AFB1的方法主要分為化學(xué)法[7]、生物法[8，9]和物理法[10]。物理法有吸附脫毒[11]、高溫降解[12]、輻射降解[13]、超聲降解[14]等方法，是目前應(yīng)用較多降解AFB1的一類方法，但大多存在著處理時間長，對產(chǎn)品風(fēng)味、營養(yǎng)成分造成不良影響，穩(wěn)定性差、產(chǎn)物不定向、成本高、安全隱患等問題。其中等離子體法因為降解時間短、無殘留在降解AFB1的研究中受到廣泛關(guān)注[15]。

等離子體(Plasma)是一種正離子和電子密度大致相等的電離氣體，由離子、電子以及未電離的中性粒子集合組成，整體呈現(xiàn)中性的物質(zhì)狀態(tài)，被稱為是除固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之外的第四狀態(tài)[16]。介質(zhì)阻擋(Dielectric barrier discharge，DBD)等離子體是低溫等離子體的種類之一，也稱無聲放電，是一種有絕緣介質(zhì)(例如石英)插入放電空間的一種氣體放電[17]，具有操作溫度低、無需外源化學(xué)試劑、節(jié)約成本等優(yōu)勢，選擇的原因是適用范圍廣、可選擇多種載氣、氣體消耗量小、有效面積大且均勻[18]。具有影響酶的活性[19]、修飾食品基質(zhì)功能特性[20]、降解毒素[21]和農(nóng)藥[22]、對農(nóng)產(chǎn)品原材料[23]進(jìn)行滅菌等作用。現(xiàn)有研究報道等離子體可降解金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B，SEB)[24]、AFB1[24，30]、赭曲霉毒素[31]、玉米赤霉烯酮[32]、嘔吐毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)[33]、T-2毒素[34]等真菌毒素，降解效果顯著。

目前使用DBD等離子體法降解AFB1的研究較少，利用DBD等離子體法降解阿月渾子堅果仁中的AFB1更是少見。本研究通過DBD等離子體法對阿月渾子堅果仁中的AFB1進(jìn)行降解，采用響應(yīng)面法優(yōu)化降解工藝條件，為AFB1的降解和等離子體法的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿月渾子堅果粉原料、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、正己烷、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、Tween-20、三氟乙酸、AFB1總量免疫親和柱、0.22 μm濾膜、1.5 mL eppendorf(EP)管、50 mL玻璃注射器。

1.2 儀器與設(shè)備

DBD等離子體(配有TDGC-0.5kVA接觸調(diào)壓器)，BF2000-30A氮吹儀，一次性無菌注射器(2 mL)，DGU-20A型高效液相色譜儀(配有RF-10A型熒光檢測器)，Model 3000型均質(zhì)器，KW-1000DC型恒溫箱，XW-80A型渦旋儀，VP-15L真空泵。

1.3 實驗裝置

實驗裝置圖如圖1所示。

圖1 DBD等離子體裝置圖

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：V(甲醇)：V(水)=50∶50，流速:0.8 mL/min，進(jìn)樣量：50 μL，熒光檢測器：激發(fā)波長：360 nm，發(fā)射波長：440 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制濃度為1、5、20、50、100、200 ng/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液各8 mL于10 mL離心管后在50 ℃下用氮?dú)饩従彺抵两?，分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，渦旋30 s，在(40±1)℃的恒溫箱中衍生15 min，衍生結(jié)束后，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⒀苌捍抵两桑贸跏剂鲃酉喽ㄈ葜? mL，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。實驗重復(fù)3次，計算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標(biāo)y，以待測樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程y=57 773.964x+166 368.663(R2=0.999 5)，數(shù)據(jù)顯示曲線擬合性良好。

1.4.3 單因素實驗

1.4.3.1 DBD等離子體放電時間的實驗

準(zhǔn)確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質(zhì)之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設(shè)定放電功率為160 W，放電間距為0.3 cm，放電時間設(shè)定為20、30、40、50、60 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[v(乙腈):v(去離子水)=84∶16]，以均質(zhì)器高速攪拌提取3 min。經(jīng)槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.3.2 DBD等離子體放電功率的實驗

準(zhǔn)確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質(zhì)之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設(shè)定放電功率為120、140、160、180、200 W，放電間距為0.3 cm，放電時間40 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[v(乙腈)∶v(去離子水)=84∶16]，以均質(zhì)器高速攪拌提取3 min。經(jīng)槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.3.3 DBD等離子體放電間距的實驗

準(zhǔn)確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質(zhì)之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設(shè)定放電功率為160 W，放電間距為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 cm，放電時間40 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[V(乙腈)∶V(去離子水)= 84∶16]，以均質(zhì)器高速攪拌提取3 min。經(jīng)槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.4 樣品的凈化

將免疫親和柱連接于50.0 mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確將處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1～3 mL/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 mL水，以2～4 mL/min穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。準(zhǔn)確加入1.0 mL色譜級甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min(1滴/s)，收集全部洗脫液于1.5 mL EP管中。將1.0 mL洗脫液在50 ℃氮?dú)庀麓蹈?，? mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

1.5 AFB1降解率的計算

1.5.1 AFB1降解后殘留量的計算

式中：X為阿月渾子中AFB1的含量/μg/kg；ρ為進(jìn)樣溶液中AFB1按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃度/ng/mL；V1為試樣提取液體積/mL；V3為凈化液的最終定容體積/mL；1 000為換算系數(shù)；V2為凈化柱凈化后的取樣液體積/mL；m為試樣的稱樣量/g。

1.5.2 AFB1降解率的計算

式中：A0為等離子體處理前阿月渾子堅果仁中AFB1初始濃度/μg/kg；A1為等離子體處理后阿月渾子堅果仁中AFB1的濃度/μg/kg。

1.6 Box-Behnken實驗設(shè)計

選取放電時間、放電功率和放電間距為主要因子，以AFB1的降解率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實驗設(shè)計，以獲得最優(yōu)實驗參數(shù)。實驗設(shè)計的因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因子和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗對AFB1降解率的影響

2.1.1 DBD等離子體放電時間對AFB1降解率的影響

由圖2可知，AFB1在功率160 W，間距0.4 cm，放電時間60 s的等離子體條件下，AFB1的降解率達(dá)到93.10%。在放電時間20～60 s范圍內(nèi)，隨著時間的增加，AFB1的降解率不斷增大，但增大幅度有所下降。對固體表面反應(yīng)有直接作用的是自由基和振動激發(fā)態(tài)物質(zhì)，離子和電子等激發(fā)態(tài)物質(zhì)在到達(dá)表面前就已經(jīng)失活。原因可能是時間越長，DBD等離子體產(chǎn)生自由基和激發(fā)態(tài)物質(zhì)的速度減慢[16]。綜合考慮，選取放電時間20、30、40 s作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素。

注：a-c表示差異顯著(P<0.05)。余同。

2.1.2 DBD等離子體放電功率對AFB1降解率的影響

由圖3可知，在等離子體放電功率為120～200 W范圍內(nèi)，隨著功率升高，AFB1的降解率呈不斷增大的趨勢。原因是DBD等離子體放電功率增大，產(chǎn)生較大的折合場強(qiáng)，從而導(dǎo)致微放電中的平均電子能量升高，活性粒子運(yùn)動速度會加快，所以電子積累的速度更快，能量密度越強(qiáng)，使得AFB1降解率增加[17]。綜合考慮，選取160、180、200 W作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素水平。

圖3 DBD等離子體放電功率對AFB1降解率的影響

2.1.3 DBD等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

由圖4可知，在放電間距0.3～0.7 cm時，AFB1降解率不斷降低。AFB1的降解率隨著放電間距的增大而減少。原因可能是間隙活性粒子的濃度降低導(dǎo)致降解效果減弱，同樣的能量在越來越大的間距之間傳遞導(dǎo)致能量密度變小，產(chǎn)生的活性氣體較少，故使降解率降低[17]。綜合考慮，選取放電間距0.4、0.5、0.6 cm作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素水平。

圖4 DBD等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

2.2 響應(yīng)面實驗

以DBD等離子體放電功率、放電時間、放電間距為自變量，根據(jù)Box-Behnken模型所設(shè)計的試驗方案進(jìn)行響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，建立AFB1降解率(Y)的回歸模型，擬合二次多項式方程如下：

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

Y=80.36-1.10A+6.81B+2.16C-0.15AB+0.87AC-2.46BC+0.45A2-3.77B2+12.25C2。

各個因素的F值反映了此因素對試驗指標(biāo)的重要程度，通過表3能夠得出，AFB1降解率受3個因素的影響依次為B>C>A，即放電功率>放電間距>放電時間。模擬一次項B、二次項B2、C2均對響應(yīng)值A(chǔ)FB1降解率影響極顯著(P<0.01)；一次項C、二次項BC交互作用顯著(P<0.05)；其余項對AFB1降解率不顯著。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

在放電間距為0.4 cm時，放電時間和放電功率對AFB1降解率的交互作用。放電功率一定時，隨著放電間距的增大，AFB1的降解率減少。當(dāng)放電間距一定時，隨著放電功率增大，AFB1的降解率不斷增大。因此，在放電功率和放電間距兩個因素相互影響下，放電功率對響應(yīng)值得影響更大。

在處理電壓為160 W時，放電時間和放電間距對AFB1降解率的交互作用。可知，放電時間一定時，隨著放電間距的增大，AFB1的降解率呈先減小后增加的趨勢。當(dāng)放電間距一定，放電時間增大，AFB1的降解率增大，但是變化幅度不大。因此，在放電時間和放電間距兩個因素相互影響下，放電間距對響應(yīng)值的影響大。

在放電時間40 s時，放電間距和放電功率對AFB1降解率的交互作用。放電間距一定時，隨著放電時間的增加，AFB1的降解率增大，但變化幅度不大；放電功率一定時，隨著放電間距增大，AFB1的降解率先降低后增加，總體趨勢降低。因此，在放電時間和放電間距兩個因素相互影響下，放電功率對響應(yīng)值的影響更大。

2.3 最佳實驗條件的預(yù)測和驗證

通過回歸模型的預(yù)測，得到DBD等離子體降解阿月渾子堅果仁中AFB1的最佳實驗條件：放電時間20 s，放電功率200 W，放電間距0.4 cm，此時AFB1的理論降解率的最大值為98.516 2%。在此最佳實驗條件下進(jìn)行實驗操作，阿月渾子堅果仁中AFB1含量從656.29 μg/kg降解至7.49 μg/kg，降解率為93.428 7%。

3 結(jié)論

DBD等離子體對阿月渾子堅果仁中的AFB1具有很好的降解作用。AFB1的降解率與放電時間和放電功率呈正相關(guān)，與放電間距呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

DBD等離子體降解阿月渾子堅果仁中AFB1的最佳工藝條件為放電時間20 s，放電功率200 W，放電間距0.4 cm。AFB1降解率與預(yù)測的值基本一致，說明該模型可用于DBD等離子體對阿月渾子堅果仁中AFB1降解效果的預(yù)測。