孫宇豪 陳恬 林皓楠 邱詩越 范維 修思琴

(成都醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，成都 610500)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作為一種常見的人類共生細菌，大約三分之一人的皮膚和鼻孔黏膜上都有這種革蘭陽性細菌[1-2]。當人體免疫力下降時，它能夠侵襲局部組織引起肺炎、骨髓炎和心內(nèi)膜炎，甚至進入血管造成感染性休克[3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)是由金黃色葡萄球菌通過基因水平轉(zhuǎn)移和自然選擇而來的一種對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有多重耐藥性的菌株。自從MRSA菌株在1961年被Jevons首次發(fā)現(xiàn)以來，其在全球范圍內(nèi)的感染率呈上升趨勢[4]，所引起的疾病目前和乙型肝炎、艾滋病一起被列為全球3大難治的感染性疾病[5-6]。

臨床上目前用于治療MRSA感染的藥物主要為萬古霉素，它可以阻斷肽聚糖合成，造成細胞壁缺陷，使菌體裂解死亡[7]。但近年來由于萬古霉素在抗感染治療中的大量應(yīng)用，MRSA對其的敏感性也逐年下降[8],并且發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(vancomycinresistanceStaphylococcus aureus，VRSA)[9]。因此，新型抗MRSA感染藥物的研究與開發(fā)是當前抗生素藥物研究的重點。

截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h由西華大學張園園教授合成[10]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)該化合物對MRSA菌株有較明顯的抑菌作用，本實驗欲通過繪制殺菌曲線、測定細菌細胞膜通透性、細菌可溶性蛋白含量和觀察細菌外部形態(tài)結(jié)構(gòu)進一步研究其抑菌作用及作用機制，為合成更有效的抗菌化合物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗菌株

MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300購自美國典型菌種保藏中心，于-80℃保存。

1.2 藥物和試劑

截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h和截短側(cè)耳素(由西華大學張園園教授提供)；萬古霉素鹽酸鹽(上海生工生物工程股份有限公司)；MH瓊脂培養(yǎng)基和MH肉湯培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司)；考馬斯亮藍R-250(德國Biofroxx公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和彩色預(yù)染蛋白分子量標準(10～170 kD)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細菌的藥物敏感性實驗

2.1.1 抑菌圈測試(DIZ)

向50℃左右的液態(tài)固體培養(yǎng)基中加入適量0.5麥氏比濁濃度的MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300菌液使培養(yǎng)基菌濃度為107CFU/mL，混勻后趁培養(yǎng)基未凝固倒平板。固體培養(yǎng)基冷卻凝固后用打孔器在中心打孔加入20 μL化合物ZYY-12h溶液作為實驗組，設(shè)立3組復孔，以萬古霉素和截短側(cè)耳素作為陽性對照，含1% DMSO的培養(yǎng)基作為陰性對照，37℃培養(yǎng)18～20 h后，用游標卡尺測定各組的抑菌圈直徑[11]。

2.1.2 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)

根據(jù)美國臨床實驗室標準協(xié)會(CLSI)標準[12]采用微量肉湯稀釋法測定截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h對MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300的最小抑菌濃度(MIC)，從128 μg/mL濃度開始倍比稀釋化合物，設(shè)立3個復孔，以萬古霉素和截短側(cè)耳素作為陽性對照，1%DMSO作為陰性對照，每一孔加入100 μL的105～106CFU/mL的菌液，輕微振蕩后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后，肉眼觀察96孔板，未見渾濁的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。再從上述MIC孔及其前4孔中取出50 μL培養(yǎng)液涂布于MH平板上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h后，培養(yǎng)皿中無細菌生長的ZYY-12h最低濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。

2.2 時間-殺菌曲線

在MH肉湯培養(yǎng)基中分別加入不同劑量的截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h使其終濃度分別為0、0.5×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC，再加入相應(yīng)對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液(106～107CFU/mL)，放入37℃培養(yǎng)箱中，在0、2、4、6、12和24 h分別取10 μL培養(yǎng)液10×倍比稀釋后接種于MH平板，37℃培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，以活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標，時間為橫坐標，繪制時間-殺菌曲線。

2.3 細胞膜通透性測試

在MH肉湯培養(yǎng)基中接種對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的濃度分別為0、1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC，在37℃恒溫搖床中連續(xù)培養(yǎng)。分別在1、2、4和6 h取各組培養(yǎng)液1 mL，4000 r/min離心10 min，取上清液用微量分光光度計測定A260[13]。

2.4 MRSA菌可溶性蛋白含量測定

在MH肉湯培養(yǎng)基中加入對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的濃度分別為0、1×MIC、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒溫搖床連續(xù)培養(yǎng)16h后，離心機4000 r/min離心10 min棄上清液，用PBS稀釋沉淀至A600為0.6，取等量各組菌懸液離心收集沉淀混懸于40 μL無菌水中，以1:4體積比加入上樣緩沖液，吹打混勻后沸水浴煮沸10 min，最后4000 r/min離心10 min取上清液進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色[13-14]。

2.5 細菌形態(tài)觀察

在MH肉湯培養(yǎng)基中接種對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使化合物的濃度分別為0、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒溫搖床連續(xù)培養(yǎng)20h后收集菌體，依次用戊二醛和梯度濃度乙醇固定脫水后送到四川大學分析測試中心用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)[15]。

2.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)。本研究中涉及到的定量資料以(x_±s)形式描述，用方差分析的方法比較組間差異，以P<0.05則差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 細菌的藥物敏感性實驗

藥敏試驗結(jié)果如表1所示， 截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h對ATCC43300和ATCC33591兩種MRSA標準菌株的抑菌圈直徑(DIZ)分別為(24.9±1.33) mm和(24.9±0.83) mm，最小抑菌濃度(MIC)均為0.125 mg/mL，與對照組相比，MRSA菌株對ZYY-12h的敏感性明顯大于其母核截短側(cè)耳素，且ZYY-12h略優(yōu)于目前臨床針對MRSA感染最常用抗生素萬古霉素。ZYY-12的最小殺菌濃度(MBC)為0.5 mg/mL，說明在較高濃度下ZYY-12h具有殺菌作用。

表1 MRSA菌株的抗生素敏感性實驗結(jié)果Tab.1 Antibiotic susceptibility test results of MRSA strain

3.2 時間-殺菌曲線

時間-殺菌曲線結(jié)果如圖2所示，正常生長曲線對照組的細菌在2 h后進入對數(shù)生長期快速增殖，10 h后增殖速度減慢但仍在緩慢增殖。在1×MIC濃度水平，ZYY-12h和截短側(cè)耳素與對照組相比在0～10 h內(nèi)均有一定的抑菌作用，且ZYY-12h組的抑菌作用更明顯，但在兩組在24 h后均未表現(xiàn)出明顯的殺菌效果。在4×MIC濃度水平，ZYY-12h和截短側(cè)耳素均有明顯的抑菌作用，在10～24 h內(nèi)使細菌數(shù)量急劇下降并且在24 h后將細菌全部殺死。

3.3 細胞膜通透性測試

細胞膜通透性測試結(jié)果如圖3所示，未用截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h處理的陰性對照組上清液6 h內(nèi)A260未出現(xiàn)明顯變化，始終小于0.08；與對照組相比，除了1×MIC組，其他經(jīng)ZYY-12h處理后的各實驗組上清液A260都有明顯的升高，且隨時間的增加而增加(P<0.05)。在相同的時間點上，ZYY-12h的濃度越高上清液在260 nm處的吸光度值也越高(P<0.05)。綜上MRSA菌株的細胞膜通透性與新截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h呈時間-效應(yīng)關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。

3.4 MRSA菌可溶性蛋白測試結(jié)果

可溶性蛋白測試結(jié)果見圖4，與未用截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h處理過的對照組相比，用ZYY-12h處理過的3個實驗組泳道大部分條帶顏色較淺，尤其是分子量大小在70和25 kD附近的兩個條帶幾乎消失；而55和15 kD附近的兩個條帶與對照組相比略有加深。同時隨著ZYY-12h的濃度增加，條帶顏色越淺，當ZYY-12h濃度達到4×MIC時，幾乎觀察不到被考馬斯亮藍染色的可溶性蛋白。

3.5 細菌形態(tài)觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖5所示，在10,000倍放大下可以觀察到對照組細菌外觀飽滿、形態(tài)規(guī)則、表面光滑，折光性好；經(jīng)過不同濃度ZYY-12h處理后，實驗組與陰性對照組相比，雖形態(tài)結(jié)構(gòu)大致完整，但細菌表面粗糙、皺縮，折光性下降，菌體之間出現(xiàn)黏連聚集；且4×MIC組細菌表面出現(xiàn)明顯的條索狀黏連隆起，菌體之間的黏連更加明顯。

4 討論

近年來由于抗生素的大量使用，細菌的耐藥問題越來越引起人們的重視，其中MRSA菌株引起的感染最為常見[16]。甲氧西林耐藥基因(mecA)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的特殊青霉素結(jié)合蛋白PBP2a是MRSA菌株產(chǎn)生耐藥性的主要原因，由于β-內(nèi)酰胺類抗生素與其親和力很低，所以無法有效抑制MRSA菌株的生長[17]。截短側(cè)耳素是1951年由哥倫比亞科學家Kavanagh等[18]從真菌擔子菌綱側(cè)耳屬Pleurotus mutilis和Pleurotus passeckerianus菌中分離提取所得，骨架由一個八元環(huán)、一個六元環(huán)和一個五元環(huán)組成，由于其能夠和細菌核糖體肽?；D(zhuǎn)移酶中心(PTC)發(fā)生作用，抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細菌的增殖[19]。目前應(yīng)用的截短側(cè)耳素衍生物主要有泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和瑞塔莫林(retapamulin)。由于目前截短側(cè)耳素及其衍生物的生物利用度較低，在人體內(nèi)無法發(fā)揮有效抑菌作用，所以只有瑞塔莫林用于臨床抗感染，主要針對化膿性皮膚病[20]。但是截短側(cè)耳素具有良好的抗菌活性和特殊的抑菌機制，且耐藥緩慢，所以設(shè)計合成截短側(cè)耳素的新衍生物對解決當前的細菌耐藥問題有十分重要的意義。

本研究測定了截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h的抑菌活性并對其抑菌機制做了初步探究。藥敏試驗測得ZYY-12h對MRSA菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.125 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)為0.5 mg/mL，比臨床抗MRSA感染最常用的萬古霉素更加敏感。在此基礎(chǔ)上測定了時間-殺菌曲線，能夠動態(tài)地觀察不同濃度ZYY-12h在不同時間抑菌活性的變化[21]。ZYY-12h對MRSA菌株的抑制主要表現(xiàn)在細菌的對數(shù)生長期，在較低濃度(1×MIC)下短時間內(nèi)可抑制細菌快速增殖但是10 h后抑菌作用逐漸減弱；較高濃度(4×MIC)下則直接表現(xiàn)為殺菌作用，24 h內(nèi)可將細菌基本殺死，說明其抑菌機制可能是抑制某些細菌增殖所必須材料的合成或者組裝，從而使細菌無法正常增殖。蛋白質(zhì)是維持細菌生命活動的重要物質(zhì)，一旦蛋白質(zhì)的生成受到抑制，細菌就無法進行正常的生命活動[22]。通過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)經(jīng)ZYY-12h處理后的MRSA細菌中可溶性蛋白含量明顯減少，分子量大小接近70和25 kD蛋白，提示ZYY-12h可能與其母核截短側(cè)耳素相似，能夠與細菌核糖體50S亞基結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。細菌的細胞膜是細菌極其重要的結(jié)構(gòu)之一，承擔著物質(zhì)轉(zhuǎn)運、呼吸和分泌、生物合成以及參與細菌分裂等重要生理功能[23]。當細菌細胞膜通透性改變時，胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)會泄漏到胞外，所以波長260 nm處上清液吸光度值被認為是反應(yīng)細胞膜通透性改變的一項重要指標。張斌等[24]就通過測定細菌懸液離心的上清液A260發(fā)現(xiàn)地榆水提液能夠使MRSA菌株細菌細胞膜的通透性改變從而抑制細菌生長。

值得注意的是本研究中經(jīng)ZYY-12h處理后的MRSA細菌上清液A260有明顯升高，提示有大量大分子物質(zhì)從細菌內(nèi)滲出， 說明改變MRSA菌株細胞膜的通透性使細菌無法維持正常的生理活動是ZYY-12h的抑菌機制之一。除此之外，本研究中經(jīng)過ZYY-12h作用后的MRSA細菌與正常MRSA細菌相比菌體表面更加粗糙且出現(xiàn)明顯皺縮，菌體之間有黏連聚集現(xiàn)象，提示ZYY-12h能夠改變MRSA菌株的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，但未到達殺滅的程度。

綜上，ZYY-12h作為截短側(cè)耳素的衍生物其抗菌機制與其母核有相似之處，都能夠抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，但細菌細胞膜通透性和外部結(jié)構(gòu)的改變均提示ZYY-12h還能夠使MRSA菌株細胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變，這可能是由于某些MRSA細菌細胞膜蛋白合成被抑制，使細菌細胞膜上的通道蛋白和載體蛋白等的轉(zhuǎn)運功能受到影響，或者是細菌細胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白減少，最終導致細菌內(nèi)外物質(zhì)交換失衡；也有可能是ZYY-12h直接作用于細菌表面的某些靶點，破壞菌體細胞膜結(jié)構(gòu)進而使其通透性改變。但其具體機制還需要進一步的實驗研究。

細菌耐藥是臨床上一大難題，目前大部分抗生素都被發(fā)現(xiàn)有相對應(yīng)的耐藥菌株，而新截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h作為一個半合成新抗生素，對MRSA具有良好的抑菌活性，有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。本研究旨在為以后合成更有效的截短側(cè)耳素衍生物提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。