杜昊楠，魏亞情，全飛， 陳偉，蘭國玉,3 ，吳志祥,3

(1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，海南 ?？?571101;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站，海南 儋州 571737)

根際微生物對植物十分重要，有研究表明，土壤微生物群落對植物的影響大于土壤理化性質(zhì)，突出對特定根際土壤微生物研究的重要性，因為植物選擇可能對調(diào)節(jié)微生物群落、影響作物產(chǎn)量等功能方面有相互作用[1]，作物產(chǎn)量依賴植物與植物根部聯(lián)系的微生物之間的密切聯(lián)系。根際細菌和真菌不同于土壤其余部分的微生物群落，對植物養(yǎng)分吸收和健康更為重要[2]，特定的植物物種對微生物群落也有影響，每個植物物種的根際都蘊藏著核心微生物和獨特的微生物，它們的相對豐度和組成是不同的[3]。根際土壤是指附著在根系附近土壤理化性質(zhì)和生物性質(zhì)與原來土體不一樣的區(qū)域內(nèi)的土壤，根際土壤中存在大量微生物，即根際微生物[4]，根際微生物可以反映出土壤的結(jié)構(gòu)質(zhì)量和土壤的肥力等性質(zhì)，對于植物也具有重要的作用，比如促進植物對于養(yǎng)分的吸收，增強植物的抗逆性，促進植物的生長，提高作物的產(chǎn)量[5]。

天然橡膠是在國防和工業(yè)中重要的戰(zhàn)略物資[6]。蘭國玉等人[7-12]對橡膠(Heveabrasiliensis)林土壤微生物群落做了深入研究，表明海南和西雙版納的橡膠林其土壤細菌群落存在顯著差異。對橡膠樹根際土壤微生物進行的研究，開展了不同耕作(施肥、間作、栽培等)模式下橡膠人工林土壤微生物生物量、土壤酶活性以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等涉及土壤肥力與健康狀況方面的研究[13]。馬萍等[14]對西雙版納橡膠根際土壤的放線菌區(qū)系進行研究，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌(Streptomyces)的分離頻率最高，且分離頻率旱季高于雨季。

西雙版納屬于熱帶季風(fēng)氣候，該地區(qū)橡膠林屬于熱帶內(nèi)陸靜風(fēng)區(qū)種植類型，而海南屬于海洋性熱帶季風(fēng)氣候，該地區(qū)橡膠林屬于熱帶島嶼型種植區(qū)類型。云南和海南是我國兩大橡膠基地[15]。橡膠林根際細菌群落的多樣性在大尺度地理位置是否發(fā)生顯著變化，是受何種影響的并不清楚。目前國內(nèi)對于大尺度空間分布下不同地區(qū)植物根際微生物的研究較少，對西雙版納地區(qū)和海南地區(qū)橡膠林根際微生物的比較研究未見報道，對于橡膠林根際微生物研究多為單一地區(qū)人工種植下的植膠區(qū)，比如海南儋州的研究，探索大尺度地理分布是否造成了橡膠林根際土壤微生物多樣性的變化、不同取樣位置的環(huán)境因素是否造成了土壤微生物組成的相異性，可以為海南與云南西雙版納橡膠林土地的管理和保護，以及對于橡膠林土壤微生物的其他研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)自然概況

海南島面積3.54×104km2(18°10′～20°10′N,108°37′～113°3′E)，屬于熱帶季風(fēng)氣候，年平均降雨量為1 750 mm[16]。

西雙版納傣族自治區(qū)位于云南省最南部(21°08′～22°36′N,99°56′～101°50′E)，面積19 690 km2,為熱帶季風(fēng)氣候，年平均溫度23.6 ℃，年平均降雨量為1 750 mm[17]，是中國生物多樣性最豐富和國際生物多樣性的熱點地區(qū)之一。

1.2 研究方法

1.2.1 樣地設(shè)置與基本情況

海南地區(qū)在儋州、萬寧、樂東等3個地區(qū)的植膠區(qū)各選取1個取樣點，西雙版納地區(qū)分別在景洪縣、勐臘縣、勐侖鎮(zhèn)等3個地區(qū)的植膠區(qū)各選取1個取樣點。每個取樣點選取3塊樣地，每個樣地均設(shè)置1塊20 m × 20 m的標準樣方。

1.2.2 樣品采集

每個樣地均設(shè)置1塊20 m × 20 m的標準樣方。以橡膠樹樹干為圓心，0.5 m為半徑，去除枯枝落葉層和表層5 cm的土壤，采集5～20 cm土壤層的土樣200 g，每個樣地采取多點取樣(每株橡膠樹取3個方向，并將每個樣點同一土層的土壤混合均勻為一個樣本)，用鐵鏟和小鏟子配合完成。用鑷子挑去里面的雜物和樹根，采集500 g土裝袋封存，在野外放入冰盒(4 ℃)里，用于理化性質(zhì)檢測，貼上標簽，迅速帶回實驗室，風(fēng)干，過2 mm篩后低溫(4 ℃)儲存，風(fēng)干做土壤養(yǎng)分分析。先將橡膠樹根系從5～20 cm土層土壤中挖出,分別剪取5～8根直徑2 mm以內(nèi)細根系，每根根系長約9～12 cm(盡量不要碰傷表皮)，抖掉與根系松散結(jié)合的土壤，將與根系緊密結(jié)合在0～5 mm范圍的土壤使用無菌刷子刷下來，放入無菌自封袋里，每個點收集5～10 g作為根際土壤,再裝入10 mL的離心管，20目篩網(wǎng)過篩處理，然后將3個土樣混合均勻，取5～10 g保存于無菌離心管中，在野外放入冰盒里，運回實驗室后盡快放入-70 ℃冰箱進行保存，用于微生物的分離及分析。

1.2.3 樣品分析和數(shù)據(jù)處理

(1)土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)指標的測定采用常規(guī)分析法[18]。土壤水分采用重量法測量；土壤pH值采用酸度計電位法(在1︰2.5的土水比溶液中);有機質(zhì)含量采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法；硝態(tài)氮測定采用水蒸氣蒸餾法，銨態(tài)氮測定采用靛酚藍比色法；速效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀含量采用醋酸銨浸提-火焰光度計法;全氮含量采用納氏比色法，全磷含量采用鉬銻抗比色法；全鉀含量采用火焰光度計法。每份樣品各項指標重復(fù)測定 3 次。

(2)高通量測序

土壤DNA提取 使用E.Z.N.A.S土壤DNA試劑盒(Omega Bio-Tek，諾克羅斯，佐治亞州，美國)從0.5克新鮮土壤中提取微生物DNA。

測序進行PCR 擴增時引物選擇 檢測細菌選擇引物為515FmodF(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)and 806RmodR(5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’)[19-20]。

有效序列數(shù)據(jù)及優(yōu)化序列數(shù)據(jù) 從2%瓊脂糖凝膠中提取Illumina MiSeq測序擴增片段，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.)進行純化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega，U.S.)進行定量。純化的擴增產(chǎn)物按等摩爾比混合，并在Illumina MiSeq平臺上按標準方案進行成對末端測序(2×250)。

(3) 數(shù)據(jù)分析

使用Uparse軟件[21](版本7.0.1090，http://www.drive5.com/uparse/)基于 97% 的相似度[21-22]對所有細菌序列進行OTU聚類分析。RDP Classifier軟件[23](版本2.11，https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)進行序列分類注釋，對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(version 138)，設(shè)置比對閾值為70%。Mothur軟件(版本1.30.2，https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)進行alpha多樣性分析。 Qiime軟件(版本1.9.1，http://qiime.org/install/index.html)生成各分類學(xué)水豐度表并進行beta多樣性距離計算。R語言(version 3.3.1)進行主坐標分析(PCoA)統(tǒng)計分析和作圖。R語言vegan包進行環(huán)境因子冗余分析(RDA)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線分析

在OUT的水平下，以樣本的Alpha多樣性指數(shù)Sobs指數(shù)值為縱坐標繪制曲線，發(fā)現(xiàn)當細菌達到55 000條時，曲線有趨向平坦趨勢，說明樣本微生物群落的檢測比率接近飽和，目前的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。西雙版納和海南地區(qū)橡膠林根際微生物的稀釋曲線，反映了在多個樣本中，西雙版納地區(qū)橡膠林根際微生物多樣性較海南高。

圖1 細菌16S 稀釋性曲線Fig.1 Bacterial 16s rarefaction curve

2.2 西雙版納與海南島橡膠林土壤細菌群落組成

在兩種根際土壤類型中，圖2結(jié)果表明不同樣本在門和綱水平優(yōu)勢物種相同，但相對豐度不同。門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、 綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)是優(yōu)勢菌門，而在西雙版納根際土中， 變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度(31.54%)顯著高于海南(22.24%)，海南的厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度(26.26%)極顯著高于西雙版納(3.15%)。綱水平上，芽孢桿菌綱(Bacilli)、放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteriashi)是優(yōu)勢菌綱，其中，海南的根際土中芽孢桿菌綱(Bacilli)的相對豐度(26%)極顯著高于西雙版納(2.98%)。除個別優(yōu)勢菌門和菌綱存在顯著性差異外，大部分低豐度物種相對豐度相似。

圖2 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)橡膠林根際細菌群落組成注：左為門水平、右為綱水平Fig.2 Composition of bacterial community in the rhizosphere of rubber Forest in Xishuangbanna and Hainan

2.3 西雙版納與海南地區(qū)橡膠林根際細菌群落Alpha多樣性

對海南地區(qū)和西雙版納樣本細菌群落多樣性指數(shù)進行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)橡膠林根際細菌多樣性指數(shù)差異Fig.3 Difference of bacterial diversity index in rhizosphere of H.brasiliensis forest between Xishuangbanna and Hainan

Ace指數(shù)和Chao指數(shù)可反映群落物種豐富度，在豐富度上，西雙版納地區(qū)根際細菌多樣性顯示都高于海南地區(qū)，但Ace指數(shù)和Chao 指數(shù)不存在顯著差異(P<0.05)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示樣品的均勻度，在均勻度上，細菌群落的Shannon和Simpson指數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。通過Shannon指數(shù)組間差異分析發(fā)現(xiàn)，西雙版納地區(qū)橡膠林根際細菌多樣性顯著高于海南地區(qū)。海南地區(qū)Simpson優(yōu)勢度指數(shù)高于西雙版納地區(qū)，實際上均勻度指數(shù)低于西雙版納。整體上看，西雙版納細菌多樣性高于海南地區(qū)。

2.4 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)土壤細菌群落結(jié)構(gòu)特征

PCoA分析下西雙版納與海南的根際土壤細菌能夠明顯分離出來，存在明顯的地理分布，Adonis檢驗得到，西雙版納與海南的地理位置因素對組間差異的解釋度為18.15%，地理分布對根際土壤細菌群落組成有很大影響，大尺度地理位置的橡膠樹根際土壤細菌群落組成存在明顯差異。PC1軸和PC2軸對結(jié)果的解釋度分別為27.13%和18.35%(圖4)。

圖4 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)橡膠林根際細菌群落的主坐標軸(PCoA)分析Fig.4 Principal coordinate(PCoA)analysis of bacterial community in the Rhizosphere of H.brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

2.5 西雙版納地區(qū)根際土壤獨有細菌多樣性較高

對西雙版納地區(qū)和與海南地區(qū)進行Venn圖分析，在屬水平比較西雙版納和海南橡膠林根際細菌微生物群落中共有和特有的屬數(shù)量，用于發(fā)現(xiàn)大尺度地理分布對根際微生物多樣性的影響。結(jié)果表明，西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)共有的細菌屬有758屬，占兩個地區(qū)所有細菌屬種類的78.39%。海南獨有的46屬，占所有菌屬的4.76%；西雙版納獨有的有163屬，占所有菌屬的 16.86%。大尺度地理分布改變了西雙版納和海南地區(qū)橡膠林根際土壤細菌在屬水平的組成，西雙版納地區(qū)根際土壤發(fā)現(xiàn)的獨有細菌屬種類高于海南地區(qū)，說明西雙版納地區(qū)根際土壤獨有細菌多樣性較高。

圖5 土壤細菌在屬水平上的維恩圖Fig.5 Venn diagram of soil bacteria at genus level

2.6 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)土壤環(huán)境因子與微生物群落的相關(guān)性

由環(huán)境因子表(表1)可知，西雙版納和海南地區(qū)橡膠林根際土壤細菌的豐度與根際土壤中的有機質(zhì)(SOM)、全磷(TP)、全鉀(TK)具有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。

表1 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)橡膠林根際細菌環(huán)境因子冗余分析解釋度Tab.1 Explanatory degree of redundancy analysis of bacterial environmental factors in rhizosphere of H.brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

通過環(huán)境因子冗余分析(RDA)分析揭示不同地區(qū)樣本細菌門水平群落組成與不同環(huán)境因子之間的相關(guān)性。第一軸和第二軸對細菌門豐度總方差的解釋率為62.38%(圖6)，雖然大多數(shù)理化性質(zhì)對根際土壤細菌的群落組成沒有顯著影響(P>0.05)，但有機質(zhì)(SOM)，全磷(TP)，全鉀(TK)是顯著影響細菌群落組成最主要的環(huán)境因子。

圖6 西雙版納地區(qū)與海南地區(qū)橡膠林根際細菌群落組成與環(huán)境因子的冗余分析注：RDA分析即冗余分析，是環(huán)境因子約束化的PCA分析，又稱多元直接梯度分析。圖中RDA1(10.49%)和RDA2(51.89%)為主成分解釋度Fig.6 Redundancy analysis of bacterial community composition and environmental factors in rhizosphere of H.Brasiliensis forest in Xishuangbanna and Hainan

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

大尺度的空間地理位置會對植物的根際土壤微生物組成造成影響，Xue等[24]對亞熱帶河流微生物群落構(gòu)成研究發(fā)現(xiàn)，生態(tài)系統(tǒng)之間的空間分布和距離可能會影響微生物群落的分布，改變微生物群落的組成。微生物分布的空間模式明顯存在。同一季節(jié)(雨季)，在門水平上，海南的厚壁菌門豐度和西雙版納具有顯著差異，芽孢桿菌綱構(gòu)成了厚壁菌門的主體，其產(chǎn)生的芽孢增加了微生物的抗逆性，對于微生物適應(yīng)極端環(huán)境有重要的作用[25]。西雙版納地區(qū)日平均氣溫穩(wěn)定≥10 ℃有效積溫都大于7 000 ℃，日平均最高積溫則出現(xiàn)在海南島地區(qū)，達到9 000 ℃[26]，由此推測海南島的積溫較高，同時海南島的土質(zhì)相對于西雙版納地區(qū)偏酸性，微生物為適應(yīng)海南島的極端氣候使得厚壁菌門的豐度變高，也與本文中綱水平上優(yōu)勢菌綱芽孢桿菌綱豐量海南地區(qū)顯著高于西雙版納相對應(yīng)。西雙版納的變形菌門高于海南，和本研究綱水平的物種豐度差異對應(yīng)——西雙版納與海南地區(qū)α變形菌綱和γ變形菌綱都屬于變形菌門，也是豐度前5位的優(yōu)勢菌綱，都為西雙版納地區(qū)高于海南地區(qū)。

對兩個地區(qū)根際土壤微生物的多樣性指數(shù)進行對比，其中不管是樣品的豐富度指數(shù)如Ace指數(shù)和Chao指數(shù)還是均勻度指數(shù)Shannon指數(shù)，均顯示西雙版納地區(qū)高于海南地區(qū)。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高， Shannon指數(shù)西雙版納顯著高于海南地區(qū)。Liu 等[3]的研究也證實了這一點，微生物群落在多個空間尺度上具有重要的空間結(jié)構(gòu)(即微生物群落特征的高空間變異性/異質(zhì)性不是隨機分布在空間中的)，土壤細菌豐富度、均勻度和香農(nóng)指數(shù)存在顯著空間差異，土壤性質(zhì)通過調(diào)節(jié)土壤生境異質(zhì)性影響物種數(shù)量。通過PCoA分析，進一步證明了大尺度的地理分布是影響橡膠林根際細菌組成的重要因素，與前人結(jié)果一致，如：周賽等[27]對于中亞熱帶毛竹(Phyllostachyspubescens)林微生物土壤的研究表明，毛竹土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)在空間尺度上存在顯著性差異，隨著地理距離的增大，土壤微生物相似度減小；韓冬雪等[28]發(fā)現(xiàn)，同一深度的紅松(Pinuskoraiensis)林土層微生物多樣性隨著海拔的升高而降低。由本研究中的Venn圖分析可知，西雙版納地區(qū)根際土壤細菌多樣性高于海南的原因之一可能是因為西雙版納地區(qū)根際獨有的細菌物種(16.86%)遠高于海南地區(qū)(4.76%)。黃藝等[29]在對干旱半干旱地區(qū)土壤微生物的研究中發(fā)現(xiàn)，地理距離對于干旱半干旱區(qū)土壤微生物空間分布格局具有顯著影響，土壤微生物對于空間分布具有生境依賴性，推測西雙版納和海南島地區(qū)根際土壤獨有微生物對于地理位置具有生境依賴性，與前人研究結(jié)果一致。

有研究表明土壤微生物地理空間分布受土壤性質(zhì)、氣候、地形和土地利用等影響因素的綜合作用，其中土壤特性對微生物分布的貢獻最大，使土壤微生物群落在緯度上顯示出很強的梯度性，而其他環(huán)境因素(如溫度、海拔)的影響較小，農(nóng)業(yè)活動減少了微生物群落豐度的變化[30]。本研究中，有機質(zhì)和全磷全鉀是影響西雙版納與海南地區(qū)橡膠林根際細菌組成的主要土壤理化性質(zhì)。有機質(zhì)是影響土壤中微生物種群數(shù)量和生物量的重要因素，有機質(zhì)含量越高，土壤中微生物種群和生物量積累越高[29]，同時，土壤細菌中的放線菌門和變形菌門與土壤有機質(zhì)顯著正相關(guān)[31]，在本研究中，變形菌門和放線菌門是西雙版納地區(qū)和海南地區(qū)橡膠林根際細菌豐度排在前3位的優(yōu)勢菌門，與前人研究結(jié)果相吻合。本研究中全鉀是影響土壤細菌空間分布的主要因素，這與魏佳寧等[32]的研究結(jié)果相一致。土壤全磷分為有機磷和無機磷，土壤中存在解磷微生物，并且有明顯的根際效應(yīng)，主要由芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌類群組成，芽孢桿菌屬是有機磷細菌，假單胞桿菌屬既是無機磷細菌也是有機磷細菌[33]。芽孢桿菌屬是橡膠林根際土壤中優(yōu)勢菌綱(芽孢桿菌綱)和優(yōu)勢菌門(厚壁菌門)的重要組成成分，假單胞菌是橡膠林根際土壤中優(yōu)勢菌綱γ-變形菌綱和優(yōu)勢菌門變形菌門的重要組成成分，全磷通過影響土壤中的優(yōu)勢物種來影響土壤的微生物組成。

3.2 結(jié)論

(1)在西雙版納和海南地區(qū)橡膠林根際土壤中，變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、酸桿菌門是優(yōu)勢菌門，芽孢桿菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、酸桿菌綱、γ-變形菌綱是優(yōu)勢菌綱。

(2)西雙版納和海南地區(qū)橡膠林根際土壤細菌群落多樣性差異顯著，在均勻度上，西雙版納地區(qū)顯著高于海南地區(qū)。橡膠樹根際土壤細菌群落組成在大尺度地理位置上存在明顯差異，西雙版納地區(qū)根際獨有細菌屬的比例較高。

(3)有機質(zhì)、全磷、全鉀是顯著影響細菌群落大尺度地理分布最主要的理化性質(zhì)。