張 歡，丁紀(jì)茹，張效科*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病慢性并發(fā)癥中最常見最容易忽視的疾病之一，以慢性高血糖和微血管病變?yōu)樘攸c的慢性、同步性、進(jìn)行性的遠(yuǎn)端對稱性多神經(jīng)病變[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)糖尿病患者中約26%的青少年、46%的成人會并發(fā)周圍神經(jīng)病變[2]，一定程度上增加了疼痛、足潰瘍、截肢的風(fēng)險；加重了抑郁的發(fā)生，降低患者生活質(zhì)量，增加社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與慢性高糖狀態(tài)下多元醇通路激活、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)的堆積、蛋白激酶C(PKC)的活化、己糖胺生物合成通路的激活、氧化應(yīng)激過表達(dá)，免疫受損，炎癥反應(yīng)中相關(guān)因子及通路的激活，神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏，血管損傷及聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase，PARP)的激活、MAPK通路的激活、刺猬(Hh)通路的抑制和Wnt通路的抑制等因素關(guān)系密切[3]。目前還沒有公認(rèn)的治療方法來預(yù)防或逆轉(zhuǎn)糖尿病周圍神經(jīng)病變，西醫(yī)多在改善生活方式、血糖控制的基礎(chǔ)上選擇甲鈷胺(修復(fù)神經(jīng))，維生素B1、B6、B12(營養(yǎng)神經(jīng))等針對病因的治療藥物或依帕司他、硫辛酸等針對發(fā)病機(jī)制的藥物治療來預(yù)防糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展，但效果多不理想。中醫(yī)藥歷史悠久，博大精深，治療糖尿病周圍神經(jīng)病變有著豐富的臨床實踐經(jīng)驗，桑樹資源在預(yù)防和治療2型糖尿病及慢性并發(fā)癥的作用已得到認(rèn)可[4]。

桑科植物去除栓皮保留根皮的桑白皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘性寒，主治傷中，能補(bǔ)虛?！睹t(yī)別錄》認(rèn)為桑白皮能去肺中水氣，利水，去熱止渴；《藥性論》認(rèn)為其能治肺氣喘滿。桑白皮活性成分較多，主要含有槲皮素、山奈酚、谷甾醇、黃酮類化合物等，藥理研究證實桑白皮及活性成分有鎮(zhèn)咳，祛痰，平喘，利尿，抗炎，降糖，降脂，外周鎮(zhèn)痛，神經(jīng)修復(fù)，調(diào)節(jié)免疫，抗氧化等作用[5]，能通過影響神經(jīng)因子的表達(dá)[6]、保護(hù)坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能[7,8]治療糖尿病周圍神經(jīng)病變。

中醫(yī)藥從整體觀和辨證分析的視角出發(fā)擅長治療復(fù)雜性的疾病，但由于中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明晰，導(dǎo)致中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展遇到困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析、選取特定信號節(jié)點進(jìn)行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科[9]，使得以整體觀為特點的中醫(yī)藥和以系統(tǒng)為方向的現(xiàn)代前沿技術(shù)有效地銜接起來，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供新機(jī)遇，指明新方向。鑒于糖尿病周圍神經(jīng)病變機(jī)制復(fù)雜性特點，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接技術(shù)從不同角度揭示中藥桑白皮對本病的干預(yù)作用，預(yù)測桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點和通路，為開發(fā)和臨床應(yīng)用桑科資源尤其是桑白皮提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)；Cytoscape 3.7.1軟件；R(x64，3.6.3)軟件；Perl語言及Windows10 3.6.3操作系統(tǒng)。

1.2 桑白皮作用靶點的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中選擇“Herb name”檢索sangbaipi，點擊拉丁名“Mori Cortex”，篩選條件為生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，將過濾到的桑白皮成分和相關(guān)靶點復(fù)制到文本框中，使用Perl語言并結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫，得到桑白皮有效成分的基因靶點。

1.3 桑白皮與DPN相關(guān)靶點的收集

使用Genecards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索“diabetic peripheral neuropathy”，將檢索結(jié)果合并，剔除重復(fù)靶點，獲得糖尿病周圍神經(jīng)病變的全部基因靶點。將桑白皮的基因靶點和疾病基因靶點使用R語言程序取交集，以篩選出共同的靶點，繪制韋恩圖。

1.4 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索桑白皮和糖尿病周圍神經(jīng)病變的共同靶點，設(shè)置隱藏游離點(hide disconnected nodes in the network)，最低互動得分要求(minimum required interaction score)中選擇highest confidence(0.900)，更新，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，下載高清PPI圖片、導(dǎo)出TSV格式。使用Perl語言對節(jié)點數(shù)據(jù)進(jìn)行屬性標(biāo)識。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，并進(jìn)行相關(guān)參數(shù)設(shè)置，最終得到“桑白皮-有效成分-糖尿病周圍神經(jīng)病變靶基因”的中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R語言將桑白皮和糖尿病周圍神經(jīng)病變共同靶點的symbol轉(zhuǎn)換為基因ID。在R語言中下載“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”安裝包，運(yùn)行R語言得到GO和KEGG的柱狀圖、氣泡圖、通路圖及包含校正后P值的結(jié)果。圖形設(shè)置只顯示校正后P值最小的前20個。使用Perl將基因的ID轉(zhuǎn)換為原始的基因靶點。

1.6 成分-靶點分子對接驗證

從RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進(jìn)行加氫、加電子等操作。從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載化合物結(jié)構(gòu)，并使用AutoDock軟件進(jìn)行加氫、加電子、加ROOT等操作。完成后對進(jìn)行分子對接的蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)置為剛性大分子，算法為Local Search Parameters，利用Pymol軟件對每個靶點與藥效成分結(jié)合能最低的結(jié)果進(jìn)行繪圖。

1.7 實驗驗證

1.7.1 實驗動物

清潔級健康雌性SD大鼠24只，體重200 g～220 g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，合格證號：SCXK(京)2018-0010。大鼠飼養(yǎng)在清潔、通風(fēng)、自然光線、溫度(25 ± 2)℃、濕度(60 ± 5)%的常規(guī)環(huán)境下，給予自由飲水及普通飼料喂養(yǎng)。

1.7.2 實驗藥物

桑白皮中藥飲片購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定。

1.7.3 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；0.1% mmol/L枸櫞酸緩沖液來自陜西中醫(yī)藥大學(xué)生化實驗室；大鼠白介素6(IL-6)(批號：20190325)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號：20190325)ELISA試劑盒購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。血糖儀及配套試紙條購自德國拜耳公司；AL204精密分析天平購自上海精科天平有限公司；Eppendorf 5810R centrifuge離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；0.22 μm注射濾器購自美國Millpore公司；石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.7.4 實驗方法

1.7.4.1 糖尿病下肢缺血模型建立

將適應(yīng)性喂養(yǎng)1周的SD大鼠分出8只給予普通飼料喂養(yǎng)(對照組)，其余給予高脂飼料(77.5%普通飼料+10%蔗糖+2.5%膽固醇+10%豬油)喂養(yǎng)4周進(jìn)行造模。用枸櫞酸緩沖液(pH 4.5，0.1% mmol/L)現(xiàn)配1% STZ濃度并一次性注射到高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠左下腹腔(按60 mg/kg體重計算劑量)，普通飼料喂養(yǎng)的大鼠注射枸櫞酸緩沖液，72 h后尾靜脈取血，用拜耳血糖儀測血糖水平，凡空腹血糖≥16.7 mmol/L的大鼠納入本次實驗研究。

所有血糖達(dá)標(biāo)的大鼠均以10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，切開左股內(nèi)側(cè)皮膚，分離股動靜脈，在坐骨神經(jīng)分三叉處，用絲線永久結(jié)扎股動靜脈，縫合切口，制成單側(cè)肢體缺血模型，術(shù)后常規(guī)注射抗生素預(yù)防感染。

1.7.4.2 實驗分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組7只和桑白皮組7只，另從普通飼料喂養(yǎng)的大鼠中選擇鼠齡、體重相當(dāng)?shù)?只組成正常對照組。糖尿病下肢缺血模型穩(wěn)定3天后進(jìn)行藥物干預(yù)。正常對照組和模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃；桑白皮組給予1.25 g/kg桑白皮濃縮液(按成人公斤體重用藥量換算)進(jìn)行灌胃，每日一次，每2周根據(jù)體重調(diào)整一次，持續(xù)4周。

1.7.4.3 治療前后空腹血糖檢測

小鼠治療前后分別尾靜脈取血，用拜耳血糖儀測空腹血糖水平并記錄。

1.7.4.4 ELISA檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6的水平

實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，無菌采集心臟血并分裝，常溫下2 000 rpm離心10 min，分離血清。按酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書采用放免法對血清TNF-α、IL-6濃度進(jìn)行檢測。

1.7.4.5 熒光光譜法檢測坐骨神經(jīng)AGEs表達(dá)

實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，充分暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，將坐骨神經(jīng)從脛腓神經(jīng)分叉處、坐骨切跡處剪斷，將坐骨神經(jīng)組織剪碎，PBS洗滌，震蕩，離心取上清液，用熒光光度計在370/440 nm處測定熒光強(qiáng)度，測定值用空白膠原酶校正，AGEs含量用AU/mg HYP表示。

1.7.4.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 桑白皮活性成分及相關(guān)靶點預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出桑白皮活性化合物32個，經(jīng)去重后得到31個桑白皮活性成分(見表1)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)桑白皮活性成分提取相關(guān)的靶點，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫，得到桑白皮活性成分相關(guān)靶點共312個。

表1 桑白皮的活性成分群

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)基因的預(yù)測及藥物-疾病靶標(biāo)的預(yù)測結(jié)果

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)疾病基因靶點，經(jīng)去重后得到4 661個疾病相關(guān)基因。使用R語言將藥物靶點與疾病相關(guān)基因取交集，得到藥物-疾病共同靶點120個。并繪制韋恩圖，如圖1所示。

圖1 韋恩圖Fig.1 Veen diagram

2.3 桑白皮-成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.7.1軟件將藥物的靶基因312個與藥物-疾病的共同靶點120個運(yùn)用Perl命令符取交集，得到桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的有效成分23個，構(gòu)建“中藥-有效成分-疾病靶基因”中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。圖中紅色橢圓形代表藥物，綠色三角形代表基因，藍(lán)色長方形代表中藥有效成分。

圖2 “桑白皮-成分-DPN靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 “Mori Cortex-active components-targets of DPN” regulatory network

2.4 桑白皮與糖尿病周圍神經(jīng)病變蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及核心基因

將韋恩圖得到的120個潛在基因錄入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析得到PPI，其包含120個節(jié)點，379條邊，平均節(jié)點度為6.32，PPI富集P值<1.0×10-16，其中節(jié)點代表蛋白，每條邊代表蛋白與蛋白之間的關(guān)聯(lián)，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，如圖3所示。將STRING中下載的TSV格式文件用R語言進(jìn)行處理，得到PPI核心基因轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)等，如圖4所示。

圖3 STRING數(shù)據(jù)庫分析蛋白的相互作用Fig.3 Protein interactions were analyzed by STRING database

圖4 PPI核心基因Fig.4 PPI network core genes

2.5 GO功能富集分析

經(jīng)R語言運(yùn)行后總共得到131個功能，前20個功能的GO功能富集的氣泡圖見圖5，校正后的P值代表富集的程度，P值越小，富集度越高、越顯著，顏色越紅；橫坐標(biāo)是關(guān)聯(lián)基因數(shù)與總基因數(shù)的比值，縱坐標(biāo)是GO的名稱。由圖可知富集最多的是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific)，其次是細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等。

圖5 GO富集分析氣泡圖(前20條)Fig.5 The GO enrichment analysis bubble diagram (Top 20)

2.6 KEGG通路富集分析

將所得的120個共同靶點使用R語言進(jìn)行KEGG通路富集分析運(yùn)行后得到155條通路，表中為顯著性最大的20條通路，并做成柱形圖(見圖6)。橫坐標(biāo)表示靶點數(shù)，縱坐標(biāo)標(biāo)注通路名稱，顏色代表富集的程度，顏色越紅，富集度越高越顯著，校正后的P值越小。結(jié)果顯示，富集度最高的信號通路是糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)，其次是卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、白介素17信號通路(IL-17 signaling pathway)、甲型流感(influenza A)、癌癥中蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、麻疹(measles)、丙型肝炎(hepatitis C)、再者有南美錐蟲病(Chagas disease(American trypanosomiasis))、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、胰腺癌(pancreatic cancer)、內(nèi)分泌耐藥(endocrine resistance)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)和膀胱癌(bladder cancer)共20條顯著性較高的通路。

圖6 KEGG通路分析的柱狀圖(前20條)Fig.6 KEGG enrichment analysis histogram (Top 20)

2.7 桑白皮核心成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

從成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)中將基因靶點以degree值高低進(jìn)行排序，選取前3個關(guān)鍵靶點(JUN、MAPK1、RELA)分別與桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的3個關(guān)鍵藥效成分(槲皮素、谷甾醇、山奈酚)進(jìn)行分子對接，對接最低結(jié)合能如表2所示。3個關(guān)鍵藥效成分與3個靶標(biāo)蛋白的最低結(jié)合能都小于0，最低結(jié)合能越小說明分子與靶點蛋白結(jié)合越好。此外，3個關(guān)鍵藥效成分與MAPK1最低結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，且均小于與RELA、JUN的最低對接結(jié)合能，說明3個關(guān)鍵藥效成分與靶點MAPK1結(jié)合能力優(yōu)于RELA、JUN。由表2可知，quercetin與靶點MAPK1、RELA的結(jié)合能力優(yōu)于其他2個關(guān)鍵藥效成分，對其對接結(jié)果進(jìn)行可視化如圖7所示，其中化合物的結(jié)構(gòu)用棍棒表示，蛋白質(zhì)的不同分支用不同的顏色表示，黃色虛線表示其氫鍵，標(biāo)記了化合物中該氫鍵與化合物的位置，quercetin與靶點MAPK1、RELA的氫鍵數(shù)目均為3個。

表2 桑白皮主要核心成分與靶點蛋白分子對接結(jié)果

圖7 分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking pattern diagram注：A：Quercetin與靶點MAPK1蛋白相互作用；B：Quercetin與靶點RELA蛋白相互作用。其中蛋白質(zhì)的不同分支用不同的顏色表示，小分子使用Stick和dot表示，黃色虛線表示其氫鍵，標(biāo)記了化合物中該氫鍵與化合物的位置。Note;A;Quercetin interacts with the target MAPK1 protein;B;Quercetin interacts with the target RELA protein.Different branches of the protein are indicated in different colors,the small molecules using Stick and dot,and the yellow dashed lines indicate their hydrogen bond,marking the position of the hydrogen bond to the compound in the compound.

2.8 各組大鼠治療前后空腹血糖的變化情況

各組大鼠治療前后空腹血糖的變化情況詳情見表3。治療前與正常對照組相比，模型組和桑白皮組空腹血糖值均有明顯差異(P<0.05)。治療后與正常對照組相比，模型組和桑白皮組空腹血糖值均有明顯差異(P<0.05)；與模型組相比，桑白皮組空腹血糖值有明顯差異(P<0.05)，與治療前相比，差異顯著(P<0.05)。說明桑白皮有一定的降血糖功效。

表3 各組大鼠治療前后空腹血糖的變化情況

2.9 ELISA檢測大鼠血清IL-6、TNF-α的水平

如表4所示，與正常對照組相比，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組相比，桑白皮組大鼠血清IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α的變化情況

2.10 熒光光譜法檢測坐骨神經(jīng)AGEs表達(dá)

如表5所示，與正常對照組相比，模型組、桑白皮組大鼠坐骨神經(jīng)AGEs增多(P<0.05)；與模型組相比，桑白皮組坐骨神經(jīng)AGEs明顯減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明桑白皮能減少AGEs表達(dá)。

表5 各組大鼠坐骨神經(jīng)AGEs表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

糖尿病周圍神經(jīng)病變在中醫(yī)古籍中無對應(yīng)病名，根據(jù)癥狀相似性原理，將糖尿病周圍神經(jīng)病變歸屬于中醫(yī)“消渴痹證”范疇更為合適，病機(jī)與消渴日久，氣陰兩虛，脈絡(luò)瘀阻有關(guān)。中藥桑白皮是?？瀑Y源桑樹的干燥根皮，能清肺胃之熱，功效堪比“小白虎湯”[10]；又能補(bǔ)虛益氣(《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草經(jīng)疏》)、活血化瘀(《本草綱目》《得配本草》)、生津止渴(《名醫(yī)別錄》《本草新編》)、止痛(《藥性論》《食療本草》)。藥理研究證實桑白皮能增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，減少B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生[11]；能降低血脂，調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂[12]；能舒張血管，增加毛細(xì)血管數(shù)目，改善血流狀態(tài)[13]；對高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的神經(jīng)有保護(hù)作用[14]。馬松濤通過系列實驗研究證實了桑白皮提取物能夠增加糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中cGMP、cAMP的含量，提高紅細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度；增加血清超氧化物歧化酶的活性，增加髓鞘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)生長因子的表達(dá)，降低神經(jīng)組織中AGE的含量，使糖尿病周圍神經(jīng)損傷得到一定程度的減輕和修復(fù)。我們發(fā)現(xiàn)目前的研究缺乏對桑白皮中有效成分作用于機(jī)體治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的多靶點、多途徑的復(fù)雜性研究，恰恰網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)彌補(bǔ)了這一缺陷。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從中藥桑白皮中篩選出31個活性成分，312個活性成分相關(guān)靶點；利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫查找到4 661個糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)基因；將中藥桑白皮和疾病糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)基因取交集，得到桑白皮-糖尿病周圍神經(jīng)病變的共同靶點120個。將桑白皮的活性成分相關(guān)靶點與桑白皮-糖尿病周圍神經(jīng)病變的共同靶點取交集，得到桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的有效成分23個，并構(gòu)建了“中藥-有效成分-靶基因-疾病”中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。將桑白皮-糖尿病周圍神經(jīng)病變的共同靶點錄入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)PPI核心基因轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)等。有研究證實外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞雪旺細(xì)胞，能夠通過衰減轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)促進(jìn)周圍神經(jīng)的再髓鞘化，改善糖尿病周圍神經(jīng)病變脫髓鞘的病理[15]； MAPK1通過抑制神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激活化蛋白激酶的激活延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展[16]；RELA、IL-6與炎癥調(diào)節(jié)反應(yīng)相關(guān)[17]；AKT1影響到胰島β細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡和再生[18]。

GO富集分析結(jié)果表明中藥桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變富集度最多的是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific)，其次是細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等。涉及基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子活性、蛋白激酶等生物學(xué)過程，表明中藥桑白皮通過參與多種生物學(xué)過程發(fā)揮干預(yù)治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。KEGG通路富集分析顯示中藥桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變通路中顯著性最高的是糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)，其次是卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等。糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號通路與氧化應(yīng)激的關(guān)系非常密切，AGE的積累和RAGE的激活可持續(xù)地誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[19]，也可以引起糖尿病患者的免疫失衡[20]，是糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)AGEs的積累可以激活p38 MAPK，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[21]。活性成分山奈酚已被證實通過減少AGE的形成和積累，減輕STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低糖尿病神經(jīng)病變疼痛敏感性[22]。MAPK信號通路由p38 MAPK、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基(N)-末端激酶1/2/3(JUK1/2/3)和ERK5四條途徑組成。MAPK信號通路與炎癥、氧化應(yīng)激、基因工程等密切相關(guān)，Ren[23]等通過研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路中的長的非編碼RNAs(IncRNAs)通過增強(qiáng)嘌呤受體介導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛、釋放炎癥因子的表達(dá)介導(dǎo)糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生。因此，可以通過干預(yù)MAPK信號通路保護(hù)糖尿病周圍神經(jīng)病變。在KEGG分析中，MAPK信號通路是富集基因較多的信號通路，我們可以推測MAPK通路可能是中藥桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路之一。腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)中具有代表性的因子當(dāng)屬TNF-α，其是一個很重要的炎癥因子，由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生，對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)纖維脫髓鞘；也刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6，加重內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷[24]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病和糖尿病周圍神經(jīng)病變患者體內(nèi)TNF-α水平升高，神經(jīng)組織中髓鞘堿性蛋白表達(dá)降低；用重組人TNF-α受體抗體融合蛋白(rhTNFR：Fc)抑制TNF-α的表達(dá)后，神經(jīng)傳導(dǎo)速度、纖維脫髓鞘及軸突結(jié)構(gòu)紊亂的現(xiàn)象得到改善，髓鞘堿性蛋白表達(dá)有所提升，說明TNF-α在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用[25]。本研究將桑白皮篩選出的核心成分與關(guān)鍵靶點全部成功對接，其中3個關(guān)鍵藥效成分與靶點MAPK1結(jié)合能最優(yōu)，3個關(guān)鍵藥效分子中槲皮素與靶點MAPK1、RELA的結(jié)合能優(yōu)于其他2個關(guān)鍵藥效成分，均小于-8.0 kJ/mol，提示桑白皮中的核心成分與關(guān)鍵靶點有著較好的結(jié)合活性，說明它們可能是治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在活性成分。說明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接技術(shù)推測出桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在活性成分和關(guān)鍵靶點具有一定的科學(xué)依據(jù)和理論支撐。酶聯(lián)免疫吸附實驗和熒光光譜實驗結(jié)果顯示，模型組中IL-6、TNF-α、AGEs水平均升高，桑白皮能夠降低IL-6、TNF-α水平，減少AGEs表達(dá)，說明其能夠抑制IL-6、TNF-α、AGEs的表達(dá)進(jìn)而保護(hù)糖尿病周圍神經(jīng)免受損害。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的角度展示了桑白皮防治糖尿病周圍神經(jīng)病變是通過槲皮素、谷甾醇、山柰酚等有效成分作用于MAPK1、JUN、RELA等多種基因靶點，從而影響AGE-RAGE信號通路、流體剪切力和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、MAPK信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、腫瘤壞死因子信號通路等多種通路發(fā)揮作用，從實驗方面也驗證了部分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，證實桑白皮治療糖尿病周圍神經(jīng)病變具有多成分、多靶點、多通路的特點。為中醫(yī)藥尤其是?？瀑Y源防治糖尿病周圍病變提供數(shù)據(jù)支撐，為?？瀑Y源的傳承與創(chuàng)新貢獻(xiàn)綿薄力量，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。