張寬朝，汪煒姿，余 平，湯雲(yún)星，羅會(huì)濤，王康威

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036

黑豆，別名烏豆、冬豆子、櫓豆等，是豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr的干燥成熟黑色種子，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱耐瘠，能在絕大多數(shù)地方，甚至是鹽堿地種植[1,2]。黑豆在我國(guó)種植面積較廣，且區(qū)域性分布相對(duì)集中，黑龍江、安徽、山西等地種植較為普遍，資源豐富，類(lèi)型多樣[1,3]。黑豆是著名的傳統(tǒng)藥食同源農(nóng)產(chǎn)品，富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、多糖、異黃酮等生物活性物質(zhì)[4,5]。黑豆種皮呈黑紅色或紫紅色，有光澤，薄而脆，易破碎，含有膳食纖維、維生素、色素、多糖、黃酮等多種活性物質(zhì)[6,7]。黑豆種皮中的花色苷不僅賦予了黑豆的顏色，而且對(duì)人體有著多種保健功效，可以抗氧化、潤(rùn)腸通便、保護(hù)肝臟、預(yù)防糖尿病、降血糖、降血脂、改善記憶力、保護(hù)視力、抗腫瘤、預(yù)防和治療哮喘等[8,9]。

花色苷提取技術(shù)的逐步改良，為其工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，使其得以廣泛用于新型化妝品、醫(yī)療保健、食品、天然染料等行業(yè)領(lǐng)域[10]。黑豆種皮花色苷傳統(tǒng)提取方法主要有水提法、有機(jī)溶劑提取法等，但這些方法存在著提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗量大、提取率低、花色苷穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[11]。近年來(lái)，超聲輔助提取[12]、微波輔助提取[13]、離子液體提取[14]等方法因具有提取時(shí)間短、提取率更高等特點(diǎn)在黑豆種皮花色苷研究中進(jìn)行了探索。已有研究發(fā)現(xiàn)，生物酶法輔助提取花色苷等生物活性物質(zhì)具有低能耗、高性價(jià)比以及提取產(chǎn)物穩(wěn)定性及活性高等優(yōu)勢(shì)[15]，但生物酶法輔助提取黑豆種皮花色苷的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用生物酶法輔助提取黑豆種皮花色苷，并以花色苷含量為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化花色苷提取工藝，同時(shí)體外試驗(yàn)分析黑豆種皮花色苷提取液的抗氧化活性，以期為黑豆種皮花色苷的提取、綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

黑豆種皮，購(gòu)自安徽亳州，批號(hào)20191209，粉碎，過(guò)100目篩，備用。

1.1.2 試劑

纖維素酶(最適pH4.8、最適溫度50 ℃，上海源葉生物科技有限公司)；α-淀粉酶(最適pH6.0、最適溫度60 ℃，上海源葉生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇、ABTS、過(guò)硫酸鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、抗壞血酸、濃鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；YP3002型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；L-600型低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；UV-1600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；FW-100型粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黑豆種皮花色苷提取與含量分析

參考Zhao等[16]法進(jìn)行黑豆種皮花色苷提取與含量測(cè)定。

式中，V：定容體積(mL)；N：稀釋倍數(shù)；98.2：花色苷在535 nm處的平均消光系數(shù)；m：黑豆種皮質(zhì)量(g)。

1.2.2 不同酶解方法對(duì)黑豆種皮花色苷提取影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.30 g黑豆種皮粉末，按照液料比25∶1 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇，分別加入纖維素酶400 U/g、α-淀粉酶50 U/g、復(fù)合酶(纖維素酶400 U/g +α-淀粉酶50 U/g)，50 ℃恒溫水浴浸提60 min，4 000 rpm離心10 min，取上清液535 nm處測(cè)定吸光度值[16]。以與乙醇等量的純水(不加酶)為空白對(duì)照。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.30 g的黑豆種皮粉末、一定量復(fù)合酶，分別考察溫度(30、40、50、60、70 ℃)、液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、60%、65%、70%、75%、80%)、酶解時(shí)間(20、40、60、80、100 min)對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響。溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間四個(gè)因素的固定水平分別為50 ℃、25∶1 mL/g、65%、60 min。在對(duì)各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，其他因素及相應(yīng)水平固定。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，以花色苷含量(Y)為響應(yīng)值，選擇復(fù)合酶酶解，選取液料比(A)、酶解溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、酶解時(shí)間(D)四個(gè)因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.5 黑豆種皮花色苷抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 黑豆種皮花色苷還原能力分析

參考Hao等[17]方法。吸取不同濃度花色苷提取液各2.5 mL，分別加入2.5 mL pH6.6磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 1%K4[Fe(CN)6]溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，300 0 rpm離心10 min，取上清液3 mL加入3 mL純水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，700 nm處測(cè)定吸光度。以抗壞血酸為對(duì)照。

1.2.5.2 黑豆種皮花色苷對(duì)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

采用鄰苯三酚法[18]。取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HC1緩沖溶液(pH8.2)，加入1 mL不同濃度的花色苷提取液和0.1 mL 6 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻，暗處反應(yīng)5 min，在299 nm處測(cè)定吸光度Ai，以等體積的純水代替鄰苯三酚，測(cè)量吸光度Ai0；以等體積乙醇浸取液代替試樣溶液測(cè)得A0。以抗壞血酸為對(duì)照。

1.2.5.3 黑豆種皮花色苷對(duì)亞硝酸根離子清除能力測(cè)定

參考Li等[19]方法。吸取不同濃度花色苷提取液各2 mL，分別與2 mL 5 mg/L NaNO2溶液混合均勻，25 ℃水浴30 min后，加入1 mL 4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，25 ℃水浴5 min后，再加入1mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，搖勻，25 ℃水浴15 min，538 nm處測(cè)定吸光度Ax?？瞻讓?duì)照液吸光度記為A0，花色苷提取液本底吸光度記為Axo。以抗壞血酸為對(duì)照。

1.2.5.4 黑豆種皮花色苷對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Wang等[20]方法。吸取不同濃度花色苷提取液各2 mL，加入2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液，搖勻，暗處反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光度Ai；用2 mL 70%乙醇分別代替DPPH溶液和花色苷試樣液，重復(fù)上述操作，分別測(cè)定吸光度Aj、A0。以抗壞血酸為對(duì)照。

1.2.5.5 黑豆種皮花色苷對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定

參考Yan等[21]方法。配制ABTS儲(chǔ)備液：分別配制7 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，等體積混合均勻，室溫暗處?kù)o置12～16 h后備用。使用時(shí)稀釋至其稀釋液在734 nm處的吸光度為0.7±0.02。

吸取不同濃度花色苷提取液各2 mL，加入4 mL ABTS稀釋溶液，振蕩搖勻，室溫暗處?kù)o置6 min，724 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i；用浸提體系的乙醇分別代替花色苷試樣液和ABTS稀釋溶液，重復(fù)上述操作，測(cè)定吸光度A0和Aj。以抗壞血酸為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。Microsoft Excel 2016繪制圖表，Design Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、多元回歸擬合分析及工藝參數(shù)優(yōu)化，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解方法對(duì)黑豆種皮花色苷提取的影響

不同酶解方法對(duì)黑豆種皮花色苷提取的影響如圖1所示?？梢钥闯?，α-淀粉酶和纖維素酶對(duì)提高黑豆種皮花色苷的提取量都有明顯效果，且纖維素酶的酶解效果略優(yōu)于α-淀粉酶。復(fù)合酶對(duì)黑豆種皮花色苷輔助提取的效果最好，可達(dá)未加酶條件下的近2倍。因此，本試驗(yàn)后續(xù)選用纖維素酶和α-淀粉酶混合而成的復(fù)合酶輔助提取黑豆種皮花色苷，并結(jié)合纖維素酶、α-淀粉酶的單一酶解進(jìn)一步探討具體試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化。

圖1 不同酶解方法對(duì)黑豆種皮花色苷提取的影響Fig.1 Effect of different enzymolysis methods on extraction of anthocyanins from black bean seed coat

2.2 溫度對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響

溫度對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響如圖2所示。分析可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，以α-淀粉酶、纖維素酶、復(fù)合酶輔助提取黑豆種皮花色苷含量均隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)闇囟忍蜁r(shí)酶的催化活性過(guò)低，不利于花色苷的溶出。隨著溫度的升高，酶的催化活性逐漸增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞膜的通透性也隨之提高，酶輔助花色苷提取的速率加快，花色苷含量上升。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，三種酶解方法輔助提取的花色苷含量都達(dá)到最大，復(fù)合酶的輔助提取效果優(yōu)于α-淀粉酶、纖維素酶，達(dá)到2.203 mg/g。隨著溫度的繼續(xù)升高，花色苷因不穩(wěn)定而分解，同時(shí)，酶的活性下降甚至失活，花色苷提取含量逐漸降低。

圖2 溫度對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響Fig.2 Effect of temperature on enzymatic extraction of anthocyanins from black bean seed coat

2.3 液料比對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響

液料比對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響如圖3所示?？梢钥闯?，在液料比為25∶1 mL/g時(shí)，α-淀粉酶、纖維素酶、復(fù)合酶輔助提取黑豆種皮花色苷含量達(dá)到最大，復(fù)合酶輔助提取最高達(dá)到2.217 mg/g。其后花色苷提取含量隨液料比的增加而減少，可能由于隨著液料比的增加，提取體系中酶的濃度減小，酶活性降低，酶的輔助提取效能減弱，不利于花色苷溶出[16]。

圖3 液料比對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on enzymatic extraction of anthocyanins from black bean seed coat

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響

生物酶法輔助提取黑豆種皮花色苷提取含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖4)。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，花色苷含量均達(dá)到最高，復(fù)合酶輔助提取的花色苷含量為2.043 mg/g。這可能由于花色苷溶于乙醇，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，花色苷溶解速度加快，花色苷含量增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)最大；之后乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，α-淀粉酶、纖維素酶的活性受到抑制甚至變性失活，同時(shí)，反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等大分子物質(zhì)發(fā)生凝聚反應(yīng)，影響花色苷的析出，導(dǎo)致花色苷含量下降。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on enzymatic extraction of anthocyanins from black bean seed coat

2.5 酶解時(shí)間對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取影響

酶解時(shí)間對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響見(jiàn)圖5。分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解時(shí)間為60 min時(shí)，黑豆種皮花色苷提取含量均最高，其中復(fù)合酶輔助提取的花色苷含量為2.016 mg/g。酶解時(shí)間大于60 min時(shí)，α-淀粉酶、纖維素酶、復(fù)合酶輔助提取黑豆種皮花色苷含量雖略有下降，但下降幅度相對(duì)平穩(wěn)。這一結(jié)果可能是由于短時(shí)間內(nèi)生物酶沒(méi)有得到充分利用，花色苷在溶液中溶解不充分，而隨著酶解時(shí)間增大，生物酶作用能力逐漸增強(qiáng)，花色苷更多地溶解于溶液，其含量逐漸提高，但隨著酶解時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，花色苷易氧化分解，導(dǎo)致含量下降。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)黑豆種皮花色苷生物酶法輔助提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on enzymatic assisted extraction of anthocyanins from black bean seed coat

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶輔助提取黑豆種皮花色苷工藝

2.6.1 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇復(fù)合酶酶解，響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3，并對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黑豆種皮花色苷含量(Y)對(duì)液料比(A)、酶解溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、酶解時(shí)間(D)的回歸方程為：Y=2.06+0.082A-0.049B-0.053C+0.030D-0.067AB-0.029AC+0.023AD-0.087BC+0.040BD+0.077CD-0.18A2-0.24B2-0.21C2-0.15D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

該回歸模型能較好反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)表3所得P值大小得出所選因素對(duì)花色苷含量的影響的強(qiáng)弱程度順序?yàn)椋阂毫媳?乙醇體積分?jǐn)?shù)>酶解溫度>酶解時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由回歸模型和方差分析可得，方程一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)提取花色苷含量達(dá)到極顯著水平。試驗(yàn)中AB(液料比與酶解溫度)、BC(酶解溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù))和CD(乙醇體積分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間)對(duì)提取黑豆種皮花色苷含量影響顯著，各試驗(yàn)影響因素之間的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖6～8。因素D、AC、AD、BD對(duì)提取花色苷含量影響不顯著。

圖6 液料比和酶解溫度對(duì)花色苷含量影響的響應(yīng)面圖(A)及等高線圖(B)Fig.6 Response surface (A) and contour (B) of the effects of liquid-solid ratio and enzymolysis temperature on anthocyanin content

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間對(duì)花色苷含量影響的響應(yīng)面圖(A)及等高線圖(B)Fig.8 Response surface (A) and contour (B) of the effects of ethanol concentration and enzymolysis time on anthocyanin content

2.6.2 最佳工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)“2.6.1”的回歸方程，可得試驗(yàn)范圍內(nèi)生物酶法輔助提取黑豆種皮花色苷最佳條件為：液料比26.3∶1 mL/g、酶解溫度48.9 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)63.9%、酶解時(shí)間59.22 min，黑豆種皮花色苷含量理論值為2.074mg/g。結(jié)合實(shí)際操作調(diào)整后優(yōu)化提取參數(shù)：液料比26∶1 mL/g、酶解溫度50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、酶解時(shí)間59 min。在此條件下驗(yàn)證試驗(yàn)得到的實(shí)際提取花色苷含量為2.019 mg/g，與理論值比較接近，一定程度上驗(yàn)證了回歸模型的有效性。響應(yīng)面優(yōu)化提取方法對(duì)復(fù)合酶提取黑豆種皮花色苷的回歸分析有一定參考價(jià)值。

2.7 黑豆種皮花色苷抗氧化活性

2.7.1 黑豆種皮花色苷還原能力

試驗(yàn)條件下，隨著花色苷提取液和抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)體系在700 nm的吸光值均呈明顯上升(見(jiàn)圖9)，表明黑豆種皮花色苷具有一定還原能力。分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度在5～15 μg/mL時(shí)，二者吸光值差距逐漸縮小，在15 μg/mL時(shí)達(dá)到最小，其后又持續(xù)增大，表明二者還原能力在15 μg/mL時(shí)最接近。吸光值達(dá)到0.5時(shí)，兩者所需樣品的有效質(zhì)量濃度IC50值分別是6.59、5.36 μg/mL，花色苷提取液的還原能力低于對(duì)照抗壞血酸。

圖9 黑豆種皮花色苷還原能力的測(cè)定Fig.9 Determination of reducing ability of anthocyanins in black bean seed coat

2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力

還原能力的測(cè)定表明花色苷具有抗氧化性，為清除自由基試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。隨著花色苷提取溶液和抗壞血酸質(zhì)量濃度的增大，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率逐漸增加，呈平滑式上升(見(jiàn)圖10)，表明兩者對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的變化規(guī)律較為一致。與鐵離子還原能力的測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)，花色苷提取溶液和抗壞血酸通過(guò)自身給出電子的還原能力作用捕獲并中和自由基。兩者對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的IC50值(清除率為50%時(shí)，所需要樣品的有效質(zhì)量濃度)分別為119.07、93.00 μg/mL，試驗(yàn)條件下花色苷提取溶液超氧陰離子自由基清除能力略弱于抗壞血酸。

圖10 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定Fig.10 Determination of superoxide anion radical scavenging capacity

2.7.3 亞硝酸根離子清除能力

由圖11可以看出，在試驗(yàn)條件下，隨著花色苷提取溶液和抗壞血酸質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)亞硝酸根離子的清除率也逐漸升高，且清除率均可超過(guò)50%，說(shuō)明二者都能很高效地清除亞硝酸根離子。分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度較低時(shí)，抗壞血酸的清除效果優(yōu)于花色苷提取溶液，但隨著質(zhì)量濃度的逐漸上升，花色苷提取溶液對(duì)亞硝酸根離子清除能力表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)?；ㄉ仗崛∪芤汉涂箟难釋?duì)亞硝酸根離子清除作用的IC50值分別為13.66、16.70 μg/mL，表明花色苷提取溶液的亞硝酸根離子清除能力強(qiáng)于抗壞血酸。

圖11 亞硝酸根離子清除能力的測(cè)定Fig.11 Determination of nitrite ion scavenging capacity

2.7.4 DPPH自由基清除能力

反應(yīng)體系中的抗氧化劑能給DPPH自由基提供電子和氫原子從而使DPPH自由基溶液發(fā)生褪色，褪色程度越大說(shuō)明清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。質(zhì)量濃度在10～50 μg/mL范圍時(shí)，花色苷提取液和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，其清除能力逐漸升高(見(jiàn)圖12)。兩者對(duì)DPPH自由基清除作用的IC50值分別為31.31、36.17 μg/mL，表明試驗(yàn)條件下花色苷提取溶液的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于抗壞血酸。

圖12 DPPH自由基清除能力的測(cè)定Fig.12 Determination of DPPH radical scavenging capacity

2.7.5 ABTS自由基清除能力

試驗(yàn)條件下，花色苷提取溶液對(duì)ABTS自由基有明顯的清除能力，且隨其濃度的增加，清除率也逐漸上升，遠(yuǎn)高于相同濃度下抗壞血酸對(duì)ABTS自由基的清除率(見(jiàn)圖13)?；ㄉ仗崛∪芤汉涂箟难釋?duì)ABTS自由基清除作用的IC50值分別為17.63、29.39 μg/mL，進(jìn)一步驗(yàn)證花色苷提取溶液對(duì)ABTS自由基清除效果強(qiáng)于抗壞血酸。

圖13 ABTS自由基清除能力的測(cè)定Fig.13 Determination of ABTS radical scavenging ability

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以乙醇為提取液，對(duì)生物酶輔助的方法提取黑豆種皮花色苷進(jìn)行了工藝優(yōu)化研究。生物酶法輔助提取植物活性成分具有綠色、無(wú)污染、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，主要根據(jù)有效活性成分大多存在于植物細(xì)胞的胞質(zhì)中，可利用纖維素酶、α-淀粉酶等對(duì)細(xì)胞壁纖維素等的生物降解作用，達(dá)到破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)等屏障通透性增強(qiáng)的目的，最大限度促進(jìn)有效成分由細(xì)胞的原生質(zhì)向提取介質(zhì)擴(kuò)散釋放，高效提取生物活性物質(zhì)[22]。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化推導(dǎo)最佳提取方案，并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，響應(yīng)面模型回歸極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，模型可以比較準(zhǔn)確地用來(lái)預(yù)測(cè)黑豆種皮花色苷提取含量隨各試驗(yàn)因素改變的規(guī)律。優(yōu)化得到的最佳工藝條件：復(fù)合酶(纖維素酶400 U/g+α-淀粉酶50 U/g)，酶解溫度為50 ℃，液料比為26∶1 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)64%，酶解時(shí)間為59 min。在此試驗(yàn)條件下，提取花色苷含量為2.019 mg/g。

對(duì)黑豆種皮花色苷抗氧化性的初步研究表明，黑豆種皮花色苷具有較好的抗氧化性，且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，其還原能力、對(duì)超氧陰離子自由基清除能力略低于抗壞血酸，但對(duì)亞硝酸根離子和DPPH自由基、ABTS自由基清除能力強(qiáng)于抗壞血酸，這與Xu[23]、Wu等[24]研究結(jié)果相一致?；ㄉ湛寡趸芰Φ漠a(chǎn)生是因?yàn)槠渚哂械墓曹椊Y(jié)構(gòu)，并且花色苷穩(wěn)定性和反應(yīng)性又受到B環(huán)上發(fā)生羥基化和甲基化程度與位置的不同的影響，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)花色苷抗氧化活性的影響[25]。研究表明，矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)是黑豆種皮花色苷的最主要成分[26]，結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，可用作為羥基供體，捕捉、結(jié)合游離自由基形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生，從而表現(xiàn)出抗氧化能力[27,28]。

試驗(yàn)表明，黑豆種皮花色苷具有較高的藥用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。但生物酶法輔助提取天然有效成分是一個(gè)較為復(fù)雜的固-液相轉(zhuǎn)移過(guò)程，細(xì)胞更多內(nèi)容物的溶出，可能導(dǎo)致更多雜質(zhì)同步帶入粗提物中[29]。黑豆種皮中花色苷含量較高，其花色苷粗提物表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，具有開(kāi)發(fā)新的花色苷資源的潛力?；ㄉ詹⒉皇呛诙狗N皮中唯一的抗氧化物質(zhì)，因此，后續(xù)進(jìn)一步純化黑豆種皮花色苷，對(duì)深入研究其有效成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及確定構(gòu)效關(guān)系具有一定的指導(dǎo)意義。