孔智謙 莫夢(mèng)瑩 陳達(dá)滿 黃海燕

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究預(yù)測(cè)參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷的主要活性成分、作用靶標(biāo)和相關(guān)信號(hào)通路，并應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷潛在作用機(jī)制。方法 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)收集參附注射液的有效活性成分和靶點(diǎn)信息;在GeneCards疾病數(shù)據(jù)和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫中收集缺血再灌注損傷疾病靶點(diǎn);取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集映射;運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，獲取核心靶標(biāo)信息;運(yùn)用R軟件進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析;最后運(yùn)用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證參附注射液核心成分對(duì)對(duì)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG作用靶點(diǎn)的調(diào)控作用。結(jié)果 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)參附注射液有效活性成分有9個(gè)，靶點(diǎn)有56個(gè)，有38個(gè)潛在作用靶點(diǎn)作用于缺血再灌注損傷的治療，包括CASP3、CASP8、IL-1β等;涉及IL-17、TNF、p53等信號(hào)通路;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證參附注射液的有效活性成分可活化IL-17和TNF信號(hào)通路，下調(diào)相關(guān)靶標(biāo)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。結(jié)論 參附注射液有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，其治療缺血再灌注損傷的作用機(jī)制可能為活化IL-17和TNF信號(hào)通路，為新藥開發(fā)和后續(xù)研究提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷;參附注射液;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);β-谷甾醇;人參皂苷

〔中圖分類號(hào)〕R256.22 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.026

〔Abstract〕 Objective To predict the main active ingredients， action targets and related signaling pathways of Shenfu Injection in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury based on the network pharmacological research， and to explore the potential action mechanism of the Shenfu Injection for myocardial ischemia reperfusion injury through in vitro experimental verification. Methods The TCM system and pharmacological database and analysis platform was used to collect the effective active ingredients and targets information of the Shenfu Injection; ischemic reperfusion injury disease targets were collected in GeneCardsdisease database and DisGeNET disease database; intersection mapping of drug targets and disease targets was carried out; the protein-protein interaction network was constructed using the STRING database to obtain core targets information; R software was used for GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis; finally， in vitro experiments were used to verify the control effect of the core component of Shenfu Injection on the activation of CASP3， CASP8， AP-1， IL-1β， IFNG. Results It is predicted that there were 9 effective active ingredients of the Shenfu Injection， 56 targets and 38 potential targets acting on the treatment of ischemia reperfusion injury， including CASP3， CASP8， IL-1β， involving IL-17， TNF， p53 signaling pathways， etc. In vitro cell experimental results confirmed that the Shenfu Injection can activate IL-17 and TNF signaling pathways， reduce the expression of relevant targets CASP3， CASP8， AP-1， IL-1β， IFNG and inhibit inflammatory response and apoptosis. Conclusion Shenfu Injection has the advantages of multi-component and multi-target， and its mechanism of action in the treatment of ischemia reperfusion injury may be the activation of IL-17 and TNF signaling pathways， which can provide reference for the development of new drugs and subsequent studies.

〔Keywords〕 myocardial ischemia reperfusion injury; Shenfu Injection; network pharmacology; interleukin-17; tumor necrosis factor; β-sitosterol; ginseng saponin

心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血后恢復(fù)心肌血液灌注，不但沒減輕心肌損傷反而造成心肌嚴(yán)重不可逆性損傷的現(xiàn)象[1]。缺血性心臟病是嚴(yán)重威脅人們生命健康的疾病，近年來隨著我國(guó)社會(huì)的發(fā)展和人民生活方式的改變，缺血性心臟病發(fā)病率不斷提高，并有年輕化的趨勢(shì)，研究顯示缺血性心臟病是我國(guó)第二大死亡原因[2]。及時(shí)恢復(fù)缺血心肌的血液灌注是治療的主要策略，臨床常用冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、溶栓治療等及時(shí)恢復(fù)心肌血液供應(yīng)，挽救壞死的心肌，臨床上取得了很好的療效，但仍無法完全防止再灌注造成的傷害。因此，尋找有效治療手段減輕心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善缺血性心臟病預(yù)后已成為現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究焦點(diǎn)。

中藥有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，在防治缺血再灌注損傷上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。參附注射液是中醫(yī)學(xué)經(jīng)典名方“參附湯”通過劑型改良提取而成的中藥注射液，在臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[4]。已有研究表明參附注射液能有效緩解和改善缺血再灌注損傷，有抗凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[5-6]，但目前參附注射液對(duì)心肌保護(hù)作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)參附注射液治療缺血再灌注損傷的主要活性成分、作用靶標(biāo)和相關(guān)信號(hào)通路，并應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示參附注射液治療缺血再灌注損傷的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 ?參附注射液的有效活性成分和靶點(diǎn)信息獲取

以“紅參”和“附子”為“Herb name”在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine

systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，藥物類藥性（drug likeness， DL）≥0.18，遴選有效活性成分。依據(jù)所選有效活性成分在TCMSP中篩選所得有效活性成分的靶點(diǎn)信息。在STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org）和UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中檢索相應(yīng)靶點(diǎn)信息的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 ?缺血再灌注損傷疾病靶標(biāo)信息獲取

以“ischemia reperfusion injury”（缺血再灌注損傷）為疾病檢索詞在GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org）中檢索相關(guān)靶標(biāo)信息，并進(jìn)行匯總?cè)ブ亍?/p>

1.3 ?構(gòu)建“參附注射液-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”

取參附注射液與缺血再灌注損傷的交集靶標(biāo)基因輸入到Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“參附注射液-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。

1.4 ?構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)

將參附注射液與缺血再灌注損傷的交集靶標(biāo)基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種“Homo”，最低相互作用閾值選擇0.400，并選擇隱藏游離的靶點(diǎn)，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息。

1.5 ?GO分析和KEGG富集分析

篩選參附注射液治療缺血再灌注損傷的關(guān)鍵基因?qū)氲絉軟件的cluster profiler包進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，使用ggplot2包進(jìn)行可視化分析，輸出GO富集分析包括分子功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和KEGG通路分析的氣泡圖。

1.6 ?體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 ?缺血再灌注損傷建模 ?購(gòu)買30只2日齡C57BL/6小鼠乳鼠，體質(zhì)量（2.05±0.37） g，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審批通過（許可證號(hào)：20200615），隨機(jī)分為對(duì)照組（n=8）、模型組（n=8）、β-谷甾醇組（n=7）和人參皂苷組（n=7）。提取小鼠原代心肌細(xì)胞，將心肌細(xì)胞放入無血清無糖的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃含5% CO2、95% N2的低氧培養(yǎng)箱中無氧培養(yǎng)4 h，后置換為含糖、含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置在37 ℃含95%空氣、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，構(gòu)建并完成心肌缺氧/復(fù)氧模型[7-9]。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，選取20 μmol/L β-谷甾醇[10]、50 μmol/L人參皂苷[11]分組給藥干預(yù)48 h。

1.6.2 ?實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) ?采用TRIzol試劑（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：15596018）提取細(xì)胞總RNA[12]，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。取適量RNA按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：RR047A）說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Takara試劑說明書（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：RR420A）操作檢測(cè)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG mRNA，選擇GAPDH為內(nèi)參基因。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：LightCycler 96）上運(yùn)行RT-qPCR反應(yīng)。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min和37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR的反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。CT值的計(jì)算公式為：2-ΔΔCt。以cDNA為模板，引物序列見表1。

1.6.3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?所有統(tǒng)計(jì)分析都使用GraphPad Prism 5.01和SPSS 20.0進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料符合正態(tài)分布，以“x±s”表示，多組間數(shù)據(jù)比較選擇單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?參附注射液活性成分篩選結(jié)果

在TCMSP中篩選出參附注射液有效活性成分9種。紅參有3種，包括β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷rh2（ginsenoside rh2）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate）;附子有6種，包括德爾妥因（deltoin）、飛燕草苷（delphin）、水黃皮素（karanjin）、去氧穿心蓮內(nèi)酯（deoxyandrographolide）、谷甾醇（sitosterol）、11，14-二十碳二烯酸（11，14-eicosadienoic acid）。各有效活性成分信息依據(jù)靶標(biāo)頻次降序排列見表2。

2.2 ?參附注射液治療缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將檢索到的參附注射液有效活性成分在TCMSP中篩選出相應(yīng)靶點(diǎn)信息，匯總?cè)ブ睾蟮玫?6個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。在GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫中檢索疾病靶點(diǎn)信息，匯總?cè)ブ睾蟮玫?676個(gè)疾病靶點(diǎn)。將參附注射液靶點(diǎn)信息與疾病靶點(diǎn)信息進(jìn)行交集映射，得到交集靶標(biāo)38個(gè)。見表3。構(gòu)建“參附注射液-缺血再灌注損傷交集靶標(biāo)”韋恩圖。見圖1。導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“參附注射液-活性成分-靶點(diǎn)信息”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

2.3 ?構(gòu)建參附注射液PPI網(wǎng)絡(luò)

將所得交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫制作PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置最低相互作用閾值選擇0.400，并選擇隱藏游離的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步分析交集靶點(diǎn)間的相互作用聯(lián)系，將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件，利用cytoHubba插件中的最大集團(tuán)中心性（maximal clique centrality， MCC）算法計(jì)算分析靶點(diǎn)得分，依據(jù)MCC得分篩選參附注射液治療缺血再灌注損傷靶點(diǎn)，得到參附注射液蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI。見圖3。篩選所得MCC得分排序見表4。

2.4 ?GO富集分析和KEGG通路富集分析

核心基因GO富集分析共獲得富集條目961條，計(jì)算各富集分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)P值，每部分P值篩選為P<0.05，排名前20的條目見圖4-6。KEGG通路富集共獲得105條富集結(jié)果，與IL-17、TNF、p53等信號(hào)通路有關(guān)，篩選排名前20的通路見圖7。運(yùn)用R軟件對(duì)IL-17、TNF信號(hào)通路進(jìn)行靶標(biāo)通路分析。見圖8-9。

2.5 ?Q-PCR檢測(cè)TNF和IL-17信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的mRNA表達(dá)均升高（P<0.05）。與模型組相比，β-谷甾醇組心肌細(xì)胞CASP3、CASP8、AP-1的mRNA的表達(dá)均顯著降低（P<0.05）;人參皂苷組心肌細(xì)胞CASP3、IL-1β、IFNG的mRNA的表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。見圖10。

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無缺血再灌注損傷的病名，依據(jù)缺血性心臟病、心肌缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)，將其歸為中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心悸”范疇，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以陽氣虧虛為本，痰瘀內(nèi)阻為標(biāo)，治療上主張急則治其標(biāo)，以活血化瘀、溫陽化氣、健脾養(yǎng)心為治療法則[13-14]。參附注射液是源自《校注婦人良方》之參附湯，由人參一兩、附子五錢組成，附子為辛溫大熱之品，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛之效，是“回陽救逆第一品藥”;人參，性甘、微苦微溫，有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智的功效[15]。現(xiàn)代研究表明參附注射液可以強(qiáng)心利尿，降血壓，減輕外周血管壓力，降低心臟負(fù)荷，緩解心肌耗氧和調(diào)節(jié)心肌脂肪酸代謝的作用，可以激活超氧化物歧化酶活性，滅活氧自由基，發(fā)揮預(yù)防和治療缺血再灌注損傷的作用[16]。臨床應(yīng)用上，已有臨床研究證明參附注射液在防治休克、心肌梗死、心力衰竭等心腦血管疾病上取得良好療效[17-19]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究參附注射液防治缺血再灌注損傷研究，初步預(yù)測(cè)了參附注射液治療缺血再灌注損傷的作用靶點(diǎn)，篩選了參附注射液所含化合物和靶點(diǎn)信息，構(gòu)建了化合物-相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)了參附注射液治療缺血再灌注損傷的生物途徑和作用信號(hào)通路，從多角度探究了參附注射液治療缺血再灌注損傷機(jī)制。本研究預(yù)測(cè)出參附注射液有效活性成分共有9個(gè)，紅參3個(gè)（β-谷甾醇、人參皂苷、鄰苯二甲酸二正辛酯），附子6個(gè)（德爾妥因、飛燕草苷、水黃皮素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、谷甾醇、11，14-二十碳二烯酸）。四環(huán)三萜類化合物β-谷甾醇是植物甾醇的主要成分之一，有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用[20]。研究表明β-谷甾醇可能作用于ERK1/2信號(hào)通路，可以上調(diào)Bcl-2/Bax、下調(diào)IL-1β、IL-6的表達(dá)，緩解缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡[21]。人參皂苷是類固醇類化合物，主要存在于人參屬中藥中，臨床研究證實(shí)人參所含的人參皂苷能發(fā)揮類似強(qiáng)心苷的作用，有擴(kuò)血管和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用[22];Cheng等[23]通過體外實(shí)驗(yàn)證明人參皂苷可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄，降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用;Wang[24]研究表明人參皂苷可調(diào)節(jié)缺血部位再灌注后血流量，通過增加谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的表達(dá)，減少缺血部位谷氨酸攝取，抑制天冬氨酸受體的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，緩解缺血再灌注損傷。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)去氧穿心蓮內(nèi)酯有抑制血小板聚集、降低炎癥因子表達(dá)的作用，楊毅猛等[25]從細(xì)胞凋亡途徑研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的細(xì)胞間黏附分子-1、TNF-α;呂俊林等[26]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯有效抑制心肌高遷移率族蛋白1、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)，減輕缺血再灌注大鼠心肌的炎癥反應(yīng)，起保護(hù)作用。

本研究共篩選出參附注射液作用靶點(diǎn)56個(gè)，與缺血再灌注損傷交集靶點(diǎn)有38個(gè)，通過對(duì)交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分析得出相關(guān)性較高的靶標(biāo)基因有CASP3、JUN、CASP8、PTGS2、IL-1β、NF-κBIA、IFNG、CD40LG、CASP1等。炎癥反應(yīng)是缺血再灌注損傷的必然病理過程，現(xiàn)有研究表明，大鼠心肌缺血再灌注損傷會(huì)促使IL-1β的高表達(dá)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放趨化因子，使局部白細(xì)胞聚集造成局部微循環(huán)障礙，損害局部心肌細(xì)胞[27-28];此外，缺血再灌注損傷使大鼠腦部海馬區(qū)IL-1β表達(dá)會(huì)增加，實(shí)驗(yàn)中人為向大鼠腦部紋狀體注射外源性IL-1β會(huì)加重大鼠缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷部位的IL-1β表達(dá)與炎癥損傷有正相關(guān)趨勢(shì)，因此抑制IL-1β的表達(dá)在治療缺血再灌注損傷中起重要作用[29]。PTGS有兩個(gè)亞型PTGS1和PTGS2，PTGS類靶點(diǎn)與人體炎癥反應(yīng)和凝血反應(yīng)有重要聯(lián)系[30]。Chen等[31]研究表明PTGS2在調(diào)控細(xì)胞增殖和抑制凋亡上發(fā)揮重要作用;Candelario-Jalil等[32]研究使用PTGS2抑制劑抑制PTGS2的高表達(dá)，能有效減輕缺血再灌注模型的炎癥表達(dá)。研究表明可溶性CD40配體與心血管疾病有極大關(guān)聯(lián)性，能預(yù)測(cè)心血管不良事件發(fā)生[33]，炎癥介質(zhì)CD40可與膜提呈的CD40配體結(jié)合產(chǎn)生活性氧和活性氮，加重炎癥反應(yīng)[34];基質(zhì)金屬蛋白酶-9可以分解腦血管周圍基底膜，破壞血腦屏障，觸發(fā)腦缺血再灌注后損傷，而腫瘤壞死因子超基因族CD40配體是一種跨膜交換蛋白，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，研究證明使用藥物抑制CD40或CD40配體能阻止基質(zhì)金屬蛋白酶-9的激活，減少腦組織損傷[35]。生物富集分析顯示，參附注射液治療缺血再灌注損傷主要通過外源性凋亡信號(hào)通路、神經(jīng)元死亡的積極調(diào)節(jié)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體結(jié)合等發(fā)揮作用。細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中起重要作用。KEGG通路富集預(yù)測(cè)與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17、TNF、p53、nod樣受體、VEGF、NF-κB、PI3K-Akt等信號(hào)通路有關(guān)。

結(jié)合KEGG通路富集分析和潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，潛在作用靶點(diǎn)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG主要富集在IL-17和TNF信號(hào)通路上。在TNF信號(hào)通路上，CASP3、CASP8、CASP1都是半胱天冬酶家族成員，是機(jī)體主要凋亡因子，而CASP3在半胱天冬酶家族發(fā)揮凋亡作用中起關(guān)鍵作用[36]，在缺血再灌注損傷病理過程中啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，加重機(jī)體損傷，抑制半胱天冬酶家族的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷[37]。在IL-17信號(hào)通路上，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AP-1可以接受細(xì)胞膜傳導(dǎo)的信號(hào)通過磷酸化作用活化，活化后的AP-1進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游IL-1β、IFNG、IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子釋放，參與炎癥反應(yīng)調(diào)控[38]。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)參附注射液核心成分β-谷甾醇和人參皂苷對(duì)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的靶點(diǎn)有調(diào)控作用，能抑制心肌細(xì)胞在缺血再灌注的情況下發(fā)生的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，也驗(yàn)證了上面網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了參附注射液治療心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，揭示了中藥注射液參附注射液有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了參附注射液的有效活性成分可能通過下調(diào)CASP3、CASP8、AP-1、IL-1β、IFNG的表達(dá)，抑制IL-17和TNF信號(hào)通路上相關(guān)下游靶點(diǎn)活化，起到抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用，從而起到防治心肌缺血再灌注損傷的作用。然而，基于中藥有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，其更多相關(guān)作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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