楊迷芳，江宏兵，潘永初，王 林

（1.江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，江蘇 南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

江蘇省口腔疾病研究重點實驗室成立于2004年，是江蘇省內(nèi)首家具有較大規(guī)模、較高檔次、開展項目較全的口腔醫(yī)學(xué)研究公共實驗平臺，隸屬于南京醫(yī)科大學(xué)和江蘇省口腔醫(yī)院，是院校共建的公共實驗平臺。實驗室自成立以來，本著資源共享、優(yōu)化配置和集約化管理的原則，充分整合空間資源、儀器設(shè)備資源和管理隊伍資源，避免了儀器設(shè)備的重復(fù)購置，提高了實驗資源的利用率，以最小的投入獲取最大的利益，集約化管理是我們實驗平臺實現(xiàn)高速發(fā)展的保障[1-2]。經(jīng)過17年的發(fā)展，本公共實驗平臺的細(xì)胞培養(yǎng)室總面積接近200平方米，擁有20臺生物安全柜，25臺細(xì)胞培養(yǎng)箱，可以同時為20名師生的細(xì)胞培養(yǎng)提供場地和配套儀器設(shè)備。平均每天有約150名師生利用該室進行與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的科研工作。集約化的管理帶給我們高速發(fā)展和便利化管理的同時，細(xì)胞污染也成為本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室最大的威脅，細(xì)胞污染一旦蔓延開來，勢必造成更大的不可挽回的損失，需要投入更多的時間，更大的人力、物力進行治理。因此預(yù)防和避免細(xì)胞污染是成為本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室管理的第一要務(wù)。我們作為如此大型的公共細(xì)胞培養(yǎng)室的管理者，總結(jié)了多年的管理經(jīng)驗，從細(xì)胞培養(yǎng)室的建設(shè)布局、制度管理、儀器管理、人員管理及操作管理的角度，分析公共實驗平臺的細(xì)胞培養(yǎng)室特有的污染風(fēng)險因素以及控制策略，希望為該類實驗室管理工作提供參考，促進該類實驗室管理工作更好的發(fā)展。

1 細(xì)胞培養(yǎng)室選址和布局

在本公共實驗平臺建設(shè)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)室從早期的20平方米經(jīng)歷多次擴建，才慢慢發(fā)展到如今的200平方米。由于建設(shè)時間跨度大，細(xì)胞培養(yǎng)室的整個建設(shè)過程缺少統(tǒng)一的規(guī)劃設(shè)計，而且細(xì)胞培養(yǎng)室的場地是由20世紀(jì)50年代的辦公場地改建而來，房屋本身承重有限，無法安裝潔凈設(shè)備，目前僅有紫外滅菌燈和空氣消毒機，無法保證細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的潔凈要求。另外，由于房屋結(jié)構(gòu)無法改變，細(xì)胞培養(yǎng)室布局結(jié)構(gòu)并不合理，導(dǎo)致無菌操作設(shè)備、孵育設(shè)備和樣本制備等設(shè)備混放在一起，實驗人員在使用過程中，常常在各實驗設(shè)備中來回穿插，造成相互之間交叉干擾。這些選址和布局方面造成的影響，從根本上增加了細(xì)胞培養(yǎng)室的管理難度。

在醫(yī)院的十四五發(fā)展規(guī)劃中，細(xì)胞培養(yǎng)室的建設(shè)是實驗室發(fā)展規(guī)劃的重點項目之一，在新的建設(shè)規(guī)劃中，我們將選址、房屋結(jié)構(gòu)作為重點因素，從規(guī)劃設(shè)計上，徹底改變細(xì)胞培養(yǎng)室管理的潛在風(fēng)險。在新的細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計規(guī)劃中，我們將細(xì)胞培養(yǎng)實驗室分為無菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲藏區(qū)、清洗和消毒滅菌區(qū)六部分。同時，這些區(qū)域的共同要求是房間要寬敞明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質(zhì)地光滑堅硬，儀器設(shè)備布局合理、方便操作。細(xì)胞培養(yǎng)室還規(guī)劃有獨立的空氣潔凈系統(tǒng)，以保證細(xì)胞培養(yǎng)室的溫度、濕度和潔凈度。細(xì)胞培養(yǎng)室各區(qū)合理布局，面積大小適中，要求同時在細(xì)胞培養(yǎng)間操作的人數(shù)不能超過4人，從根本上降低細(xì)胞培養(yǎng)室環(huán)境污染的風(fēng)險[3-4]。

2 細(xì)胞培養(yǎng)室管理辦法

近年來，隨著本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)模不斷擴大，使用人數(shù)也不斷攀升，使用人員日趨復(fù)雜，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題也逐漸多樣化。而早期制定的細(xì)胞培養(yǎng)室管理辦法，大多從網(wǎng)上照搬過來，這些條例內(nèi)容大多相似，而且僅強調(diào)無菌操作區(qū)規(guī)范，忽略了人員進出、物品進出、物品擺放、培養(yǎng)箱的使用、實驗垃圾的處理等各個環(huán)節(jié)的規(guī)章制度建設(shè)，造成管理制度與實際管理脫節(jié)，無法保證細(xì)胞培養(yǎng)室的有序進行。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)室布局示意圖

針對以上問題，我們在管理過程中，我們收集了在管理中，經(jīng)常出現(xiàn)的問題，并深入分析問題的本質(zhì)，進而細(xì)化出相應(yīng)的規(guī)章制度，從而制定出了針對性強、涵蓋面廣、流程化、可操作的管理辦法，從根源上減少導(dǎo)致細(xì)胞污染事件的發(fā)生。我們分別制定了《細(xì)胞培養(yǎng)室人員進出制度》《細(xì)胞培養(yǎng)室物品進出和擺放制度》《細(xì)胞培養(yǎng)實驗操作步驟》《細(xì)胞培養(yǎng)室廢棄物處理制度》《細(xì)胞培養(yǎng)室儀器設(shè)備使用和維護管理制度》《細(xì)胞培養(yǎng)室突發(fā)應(yīng)急事件管理條例》《細(xì)胞培養(yǎng)室違規(guī)行為處罰條例》等針對細(xì)胞培養(yǎng)過程全流程的管理辦法，并將重要的注意事項制作成展板或卡片張貼在醒目位置，提醒實驗人員規(guī)范操作。細(xì)胞培養(yǎng)室的管理從粗放到逐步完善的精細(xì)化管理，增強了研究生的規(guī)范意識，減少了細(xì)胞培養(yǎng)室污染的潛在風(fēng)險[5-7]。

3 培訓(xùn)與考核

本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室作為公共實驗平臺，對本院所有學(xué)科的師生開放，同時還接收兄弟院校師生的申請。目前，每年使用培養(yǎng)室登記在冊約150人，其中80%為碩士研究生，他們來自不同的專業(yè)和年級，其中90%學(xué)生在進入實驗室之前，對細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)章制度缺乏了解，對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)知之甚少，對操作技術(shù)的掌握幾乎為零。本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室在管理初期，僅針對初入細(xì)胞培養(yǎng)室的學(xué)生進行規(guī)章制度以及具體的實驗操作進行系統(tǒng)培訓(xùn)，通過培訓(xùn)考核后即可進入細(xì)胞培養(yǎng)室操作。由于訓(xùn)練的時間較短，很多初入實驗室的學(xué)生對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)掌握并不牢固，往往會跟著課題組內(nèi)的師兄、師姐繼續(xù)練習(xí)。而部分師兄、師姐由于長時間的操作后，對細(xì)胞培養(yǎng)室的規(guī)章制度、操作流程往往持麻木態(tài)度，逐漸出現(xiàn)懈怠思想，在操作細(xì)節(jié)上逐漸出現(xiàn)問題，比如：進出細(xì)胞房不穿鞋套、實驗操作時不戴手套、實驗前后不消毒安全柜臺面等。這種高年級學(xué)生帶低年級學(xué)生的“幫、傳、帶”傳授方法，往往存在錯誤示范，循環(huán)往復(fù)之下，實驗室的污染風(fēng)險更加嚴(yán)重。而且，這種由于操作行為引起的污染，往往會造成整個培養(yǎng)室環(huán)境的污染，卻難以尋找污染的源頭。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)室管理制度中，增加系統(tǒng)的規(guī)章制度培訓(xùn)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)操作培訓(xùn)的頻次，并且加強現(xiàn)場巡查指導(dǎo)和糾錯機制必不可少[8]。

針對此情況，本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室，制定了以下培訓(xùn)和考核制度。培訓(xùn)方式包括PPT學(xué)習(xí)和現(xiàn)場操作培訓(xùn)。我們將細(xì)胞培養(yǎng)室培訓(xùn)內(nèi)容制作成PPT課件供申請者網(wǎng)上學(xué)習(xí)，并根據(jù)PPT培訓(xùn)內(nèi)容建立考試題庫。PPT培訓(xùn)內(nèi)容包括細(xì)胞培養(yǎng)室人員進出、物品進出、實驗操作步驟、儀器設(shè)備使用維護管理、物品存儲管理、實驗突發(fā)情況管理、違規(guī)處罰等全流程的規(guī)章制度，以及儀器設(shè)備使用方法和細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟?，F(xiàn)場操作部分由管理老師現(xiàn)場帶教，實驗人員現(xiàn)場實操，直到學(xué)會獨立操作為止。本平臺每月組織一次考核，線上題庫和現(xiàn)場操作考核全部通過后，方可進入細(xì)胞培養(yǎng)室開展實驗。題庫考核和現(xiàn)場實操考核結(jié)果不合格者，必須重新進行培訓(xùn)，并再一次進行考核，直到完全通過考試。另外，管理老師每天巡查細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)學(xué)生現(xiàn)場操作，發(fā)現(xiàn)違規(guī)行為及時糾錯，并將違規(guī)行為記錄在冊，建立違規(guī)操作名冊，按照處罰條例進行處理，違規(guī)積累超過三次者，將重新參加培訓(xùn)和考核。通過以上培訓(xùn)、考核和現(xiàn)場巡查制度，促使師生養(yǎng)成規(guī)范操作的習(xí)慣，極大地減少了污染率（見圖2，P52）。

圖2 人員培訓(xùn)流程圖

4 儀器設(shè)備檢驗維護

本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室共分為三個小型細(xì)胞培養(yǎng)室，每個細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)平均配備8臺細(xì)胞培養(yǎng)箱、7臺生物安全柜、2顯微鏡、2臺離心機、1臺細(xì)胞計數(shù)儀、4臺冰箱、2臺渦旋儀等，每個細(xì)胞培養(yǎng)室約50人使用。細(xì)胞培養(yǎng)箱按照課題組進行分組，每層固定人員使用，生物安全柜按照時段預(yù)約排隊使用。據(jù)統(tǒng)計，細(xì)胞培養(yǎng)箱每小時至少有1次開關(guān)記錄，生物安全柜每天至少8人次預(yù)約使用，冰箱、顯微鏡、離心機、細(xì)胞計數(shù)儀等設(shè)備開關(guān)次數(shù)更是不計其數(shù)，這些儀器設(shè)備在使用過程中，如此高頻次的與不同細(xì)胞系和不同操作者接觸，逐漸成了細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)潛在的污染因素的“溫床”。在管理初期，細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)儀器設(shè)備由于缺乏全面性管理手段，常常由學(xué)生自己負(fù)責(zé)對設(shè)備進行維護管理，儀器設(shè)備消殺檢驗和維護更新更是不及時，一旦發(fā)生污染，將會引起快速蔓延。

針對此情況，我們廣泛收集細(xì)胞培養(yǎng)室儀器管理方法的技術(shù)資料，認(rèn)真學(xué)習(xí)，結(jié)合本室的實際情況整理匯總，制定出詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)儀器設(shè)備管理辦法[9-10]。例如：細(xì)胞培養(yǎng)箱箱體和附件每月用75%酒精噴灑內(nèi)腔清潔消毒，每六個月進行一次箱內(nèi)的高溫滅菌；培養(yǎng)箱內(nèi)增濕水盤每周使用75%酒精噴灑消毒一次，并更換水盤內(nèi)的蒸餾水，同時按比例添加抑菌劑；開關(guān)培養(yǎng)箱取用細(xì)胞時，先用75%酒精消毒雙手，再打開培養(yǎng)箱的門，取出的細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)箱先用75%酒精噴灑表面，再進行下一步操作；使用顯微鏡時，先用酒精噴灑載物臺，再將細(xì)胞放到載物臺上進行觀察；顯微鏡的鏡頭每周使用吸耳球清潔一次，注意不要用水擦試鏡頭，避免鏡頭表面殘留水跡，可能滋生霉菌，損壞顯微鏡并引起污染；使用生物安全柜前后，均需使用75%酒精擦拭清潔表面，避免交叉污染；每半年清潔一次生物安全柜的底部和內(nèi)腔表面，清除底部和內(nèi)腔表面的拋灑物；定期更換生物安全柜內(nèi)的紫外消毒燈；冰箱門表面、離心機內(nèi)腔、細(xì)胞計數(shù)儀、渦旋儀等設(shè)備，每天使用75%酒精進行兩次表面消毒。通過這些儀器設(shè)備維護舉措，有效降低了儀器設(shè)備帶來的污染隱患[11]。

5 污染事件上報處理

目前，本平臺細(xì)胞培養(yǎng)實驗中常用的培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶、圓底細(xì)胞培養(yǎng)皿和方底細(xì)胞培養(yǎng)板，不管是哪種培養(yǎng)器皿，由于其體積較小，邊緣光滑，在從細(xì)胞培養(yǎng)箱中拿取時，稍不注意，都會有打翻或滑落的情況發(fā)生。加上本實驗室培養(yǎng)箱資源緊張，每個培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)器皿都是多層疊放，在拿取時，更是經(jīng)常發(fā)生打翻的情況。培養(yǎng)器皿一旦打翻或滑落，就會造成細(xì)胞和培養(yǎng)液的拋灑，拋撒的細(xì)胞和培養(yǎng)液會污染細(xì)胞培養(yǎng)箱的層板、水盤和其他學(xué)生的細(xì)胞樣本。在早期實驗室管理制度中，由于缺乏明確的污染事件上報流程和處理機制，導(dǎo)致學(xué)生不主動上報，管理老師對污染事件不知情，不能對污染事件作出分析和評估，更沒有及時的處理措施。此時，沾染有拋灑液體的培養(yǎng)箱擱架、水盤和已經(jīng)污染的細(xì)胞就會成為新的污染源，導(dǎo)致污染擴散，給更多的師生的實驗研究造成難以估量的損失。

針對上述情況，本平臺細(xì)胞培養(yǎng)室制定了嚴(yán)格的污染上報流程和處理措施。首先管理老師制作了《污染事件上報調(diào)查表》，表格中內(nèi)容包含污染發(fā)生日期、使用細(xì)胞培養(yǎng)箱位置、污染事件描述、細(xì)胞類型、污染時細(xì)胞形態(tài)變化，課題組內(nèi)實驗物品共用情況等，本調(diào)查表每周下發(fā)給學(xué)生，并要求所有使用細(xì)胞培養(yǎng)室人員參與調(diào)查。除定期調(diào)查污染事件以外，學(xué)生在實驗過程中如有緊急污染事件發(fā)生，也可隨時填寫本表，進行上報。管理老師根據(jù)每周上報的情況，分析細(xì)胞污染原因，針對性作出處理方案，處理方案執(zhí)行結(jié)束后進行回訪，形成一個閉環(huán)管理。通過以上上報機制和處理機制，大大提高了細(xì)胞污染事件的處理效率，有效避免了大規(guī)模污染事件的發(fā)生。

圖3 污染事件處理流程圖

6 結(jié)語

本公共實驗平臺自成立以來，在南京醫(yī)科大學(xué)和江蘇省口腔醫(yī)院的大力支持下，不斷地加強建設(shè)，引進了很多先進實驗設(shè)備，硬件設(shè)施處于全省前列，本平臺為院校科研事業(yè)的高速發(fā)展作出了巨大的貢獻。但是，本公共實驗平臺的管理模式，相對于世界其他發(fā)達(dá)國家還比較落后，還存在很多問題有待解決，為了縮短落后距離，跟上時代步伐，我們的管理模式必須進行探索和改革[12]。細(xì)胞培養(yǎng)室作為本公共實驗平臺中至關(guān)重要的一部分，更應(yīng)發(fā)揮其管理模式的先鋒作用。我們作為一線的細(xì)胞培養(yǎng)室的主要管理者，應(yīng)始終堅持以問題為導(dǎo)向，主動深入分析和思考，勇于改革創(chuàng)新，探索出一條有自己特色的管理模式，為院校的科研事業(yè)提供堅實的保障。