侯力丹，劉 丹，翟天舒，毛婭卿，王 嘉，孔冬妮，黃小潔，楊漢春，張亞文，趙 鵬，李俊平

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒是雞群中常見的垂直傳播性病毒，他們感染雞群后不僅會(huì)導(dǎo)致發(fā)生腫瘤，還常常引起免疫抑制，導(dǎo)致疫苗免疫失敗等時(shí)常發(fā)生。此前，多個(gè)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，REV與ALV的共感染在雞群中是一種典型的流行病學(xué)現(xiàn)象，共感染比單一感染對雞群造成的致病性更強(qiáng)，誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的免疫抑制。人工致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明REV與ALV-J共感染具有顯著的協(xié)同致病作用[1-2]。

除了經(jīng)典的致病性較強(qiáng)的ALV-J外，流行病學(xué)調(diào)查及在對種雞開展病毒分離鑒定的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，A亞群ALV（ALV-A）是蛋雞中常見的流行亞群[3-4]，特別是蛋雞群中還會(huì)出現(xiàn)一定比例的REV與ALV-A共感染現(xiàn)象。作為雞群中最常見的兩種免疫抑制性病毒，單感染REV或ALV-A以及兩者共感染雞后免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)的系統(tǒng)觀察，目前還未有系統(tǒng)的研究報(bào)道。為此本研究利用SPF雞通過人共感染的方式使其感染上述兩種病毒，后對試驗(yàn)雞的多個(gè)免疫學(xué)相關(guān)的監(jiān)測指標(biāo)進(jìn)行了檢測和比較分析，觀察了REV與ALV-A各自單感染或者共感染后誘導(dǎo)SPF雞的免疫學(xué)反應(yīng)及其差異。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和毒株REV（MD-2株）分離自某污染的雞馬立克氏病疫苗中[5]，已完成其全基因組測序（GenBank登錄號：JX912710）；ALV-A野毒株SDAU09C1株分離自引進(jìn)的白羽肉用型祖代雞[4]，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病研究室崔治中教授饋贈(zèng)，已完成其全基因組測序（GenBank登錄號：HM452339）?？蓞^(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV的DF-1細(xì)胞購自美國菌種保藏中心（ATCC），用于病毒的增殖和定量。

1.2 抗體與檢測試劑盒針對REV的單克隆抗體MAb11B118由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病研究室崔治中教授饋贈(zèng)，間接免疫熒光的工作濃度為1∶2000；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自美國Sigma公司；RPE標(biāo)記的鼠抗雞CD8α抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗雞CD4抗體均購自美國SouthernBioteck公司；禽白血病p27群特異性抗原酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒購自北京愛德氏元亨生物科技有限公司；用于檢測雞白細(xì)胞介素（Interleukin, IL）1、2、4、5、10、12、18，雞腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）及雞γ干擾素（Interferon γ, IFN-γ）等多種細(xì)胞因子的商品化ELISA檢測試劑盒購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1日齡SPF雞共計(jì)160只，購自北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)平均分為4組，分別隔離飼養(yǎng)于4臺負(fù)壓隔離器中。第1組每只經(jīng)皮下注射無菌生理鹽水0.2 mL，作為空白對照組；第2組每只雞經(jīng)皮下注射ALV-A SDAU09C1株1000 TCID50，作為ALV-A單獨(dú)攻毒組；第3組每只雞經(jīng)皮下注射REV MD-2株1000 TCID50，為REV單獨(dú)攻毒組；第4組每只雞經(jīng)皮下注射兩種病毒的混合液0.2 mL，分別含有兩種病毒500 TCID50，為REV和ALV-A共感染攻毒組。于攻毒后第2周對各組SPF雞無菌采集抗凝血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，以確認(rèn)REV和ALV-A感染成功。分別于攻毒后第2周、4周、6周、10周、12周、14周從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取6只SPF雞，無菌采血分別分離淋巴細(xì)胞和血清。

1.4 REV與ALV-A共感染對細(xì)胞因子含量的影響對1.3中不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)采集的血清樣品，分別應(yīng)用各種細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒，按照試劑盒使用說明書分別檢測雞IL-1、2、4、5、10、12、18，TNF-α和IFN-γ的濃度，相關(guān)數(shù)據(jù)使用t-test統(tǒng)計(jì)分析各組不同細(xì)胞因子濃度差異。

1.5 REV與ALV-A共感染對外周血T淋巴細(xì)胞分群的影響采集抗凝血，分離淋巴細(xì)胞并對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照流式細(xì)胞術(shù)的步驟將淋巴細(xì)胞處理為107個(gè)/mL的密度，分別以CD8α抗體和CD4+抗體對其進(jìn)行染色，進(jìn)行CD8+及CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算CD4+/CD8+比值，以t-test統(tǒng)計(jì)分析各組間數(shù)據(jù)差異。

1.6 REV與ALV-A共感染對外周血細(xì)胞部分Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響參照NCBI上已公布的雞β-Actin及Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）的mRNA序列，使用Primer Version 5.00軟件（PREMIER Biosoft international，3786 Corina Way，Palo Atto，CA）分別設(shè)計(jì)和合成用于檢測β-Actin、chTLR2 type1、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR6、chTLR7、chTLR15等各受體基因的real-time PCR檢測引物（表1），以上述引物擴(kuò)增各基因片段后構(gòu)建的克隆質(zhì)粒為模板，繪制熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。對提取的外周血淋巴細(xì)胞總mRNA首先以d18T為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，然后以各相關(guān)引物對cDNA進(jìn)行real-time PCR檢測。統(tǒng)計(jì)分析各組間Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

表1 熒光定量 PCR引物列表Table 1 Primers of real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 REV與ALV-A病毒分離結(jié)果REV單感染和共感染后2周，對REV感染后的雞采血接種DF-1細(xì)胞，接種細(xì)胞后第7 d時(shí)以細(xì)胞固定液固定，然后以REV的單克隆抗體MAb11B118進(jìn)行間接免疫熒光檢測，所有細(xì)胞樣品均顯示出典型的染色特征（圖略），判定為存在REV感染，證實(shí)人工攻毒實(shí)驗(yàn)成功，血液中REV分離陽性率均為100%。ALV-A單感染和共感染后2周，對ALV-A感染后的雞采血接種DF-1細(xì)胞，接種細(xì)胞后7 d時(shí)取細(xì)胞上清液，所有上清液以禽白血病p27群特異性抗原酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒按照試劑盒說明書檢測，均為陽性（S/P數(shù)值略），判定為存在ALV感染，證實(shí)人工攻毒實(shí)驗(yàn)成功，血液中ALV-A分離陽性率均為100%。

2.2 REV與ALV-A共感染對細(xì)胞因子變化的影響以ELISA方法檢測各組雞不同時(shí)間點(diǎn)IL-1等9種細(xì)胞因子的含量。如表2所示，各感染組IL-1濃度與空白對照組差異不顯著，表明不管是REV與ALV-A單感染還是兩者共感染對IL-1的分泌影響不顯著。感染后2周時(shí)，相對ALV-A單感染組以及空白對照組，REV單感染組和共感染組的IL-2濃度出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.05），但在感染后12周時(shí)，各感染組IL-2濃度又極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。2～6周內(nèi)，相對于空白對照組和REV單感染組，共感染組IL-18濃度升高，但差異不顯著（P＞0.05）。感染2周時(shí)，各感染組的IFN-γ濃度相對于空白對照組均顯著下降，共感染組顯著低于空白對照組（P＜0.05）。感染4周后，各實(shí)驗(yàn)組IFN-γ的濃度高于空白對照組，6周后，ALV-A單感染組極顯著（P＜0.01）高于空白對照組，到第10周時(shí)REV單感染組顯著高于空白對照組（P＜0.05）。感染2周時(shí)，共感染組TNF-α濃度顯著高于其他組（P＜0.05），但在4周時(shí)卻顯著低于其他組（P＜0.05）。14周時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組TNF-α濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。

2.3 REV與ALV-A共感染對雞外周血CD4+及CD8+ T淋巴細(xì)胞分群的影響如表3所示，在感染后2周，各感染組較空白對照組的CD4+T淋巴細(xì)胞比例均有不同程度升高，其中REV單感染組顯著高于ALV-A單感染組及空白對照組（P＜0.05）；在感染后4～12周內(nèi)空白對照組CD4+T淋巴細(xì)胞比例始終高于各感染組，在第10周時(shí)共感染組顯著低于REV單感染組（P＜0.05），更極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。如表4所示，在感染后2周，相對于空白對照組，各感染組CD8+T淋巴細(xì)胞比例均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢，其中REV單感染組極顯著高于ALV-A單感染組和空白對照組（P＜0.01），ALV-A單感染組和共感染組顯著高于空白對照組（P＜0.05）；10～14周時(shí)，各感染組均高于空白對照組，特別在第12周時(shí)，各感染組CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著或極顯著高于空白對照組，在第14周時(shí)，除了REV單感染組外，ALV-A單感染組和共感染組均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。如表5所示，各組間不同采樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)CD4+/CD8+比值的差異較明顯，其中在感染后第2周、6周時(shí)，共感染組該比值顯著低于空白對照組（P＜0.05）；12周時(shí)，各感染組該比值均極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。

2.4 REV與ALV-A共感染對外周血細(xì)胞部分Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響以表1所列引物分別對外周血淋巴細(xì)胞中β-Actin以及多種Toll樣受體進(jìn)行了Real-Time PCR檢測，以Toll樣受體基因的Ct值與同一樣品β-ActinCt值的比值來表示Toll樣受體相對轉(zhuǎn)錄水平。如表6所示，在所有時(shí)間節(jié)點(diǎn)，各組間chTLR2 type1和chTLR6相對轉(zhuǎn)錄水平均無顯著性差異（P＞0.05）。對于chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相對轉(zhuǎn)錄水平，除了感染后10周時(shí)ALV-A單感染組極顯著高于對照組外（P＜0.01），各組間其他時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

REV和ALV作為雞群中常見的兩種免疫抑制性病毒，其單獨(dú)感染或者共感染后導(dǎo)致的免疫抑制一直是備受關(guān)注的問題，特別是導(dǎo)致禽流感和新城疫等疫苗免疫失敗是對家禽生產(chǎn)的重大危害之一[1-2]。此前，對REV和ALV誘導(dǎo)的免疫抑制主要是從疫苗免疫后的抗體滴度等角度觀察兩者單獨(dú)感染或者共感染后的免疫抑制作用，對于兩者單獨(dú)感染或者共感染對先天免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)方面的影響，一直缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。為此本研究通過在動(dòng)物試驗(yàn)中對血清中代表性細(xì)胞因子的含量、外周血T淋巴細(xì)胞分群以及外周血部分Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平等多項(xiàng)指標(biāo)的監(jiān)測與比較，來分析REV和ALV-A兩者單獨(dú)或者共感染狀態(tài)下誘導(dǎo)SPF雛雞免疫反應(yīng)的差異性。

表2 REV與ALV-A單感染及共感染對雞血清細(xì)胞因子濃度的影響（±SD，單位：ng/L）Table 2 Influence on concentration of cytokines in chicken serum infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: ng/L）

表3 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD4+細(xì)胞比例的影響（±SD，單位：%）Table 3 Influence on percentage of CD4+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: %）

表4 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD8+細(xì)胞比例的影響(± SD，單位: %)Table 4 Influence on percentage of CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A (± SD, unit: %)

表5 REV與ALV-A單感染及共感染對雞外周血CD4+/CD8+比值的影響（±SD）Table 5 Influence on ratio of CD4+/CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

表6 REV與ALV-A單感染及共感染雞外周血淋巴細(xì)胞chTLRs mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平（±SD）Table 6 Relative transcription level of chTLRs in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

近年來，雞相關(guān)細(xì)胞因子的研究取得多項(xiàng)進(jìn)展，如IL-1、IL-2、IL-4等。本研究選擇9種代表性細(xì)胞因子進(jìn)行了測定，結(jié)果表明REV與ALV-A單感染或共感染對雞血清中IL-1等9種細(xì)胞因子的濃度總體影響不顯著，但在感染后12周或14周時(shí)，共感染會(huì)使IL-2、IL-4濃度下降且顯著低于空白對照組。IL-2具有非常重要的免疫調(diào)節(jié)作用，能調(diào)控免疫系統(tǒng)中白血球的細(xì)胞活性，促進(jìn)Th和CTL的增殖，促進(jìn)B細(xì)胞分化及分泌抗體、誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細(xì)胞因子、增強(qiáng)單核細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷活性等多種功能[6]。IL-4主要在調(diào)節(jié)體液免疫中起重要作用，能刺激活化B細(xì)胞增殖和成熟及促進(jìn)抗體的生成、誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和抗凋亡、參與調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化成TH2型細(xì)胞[7]。相關(guān)數(shù)據(jù)證實(shí)REV與ALV-A共感染會(huì)使IL-2、IL-4濃度下降，其結(jié)果必然會(huì)進(jìn)一步影響疫苗免疫抗體的產(chǎn)生。

T淋巴細(xì)胞是重要免疫細(xì)胞，根據(jù)表面抗原結(jié)合受體的不同將其分為不同亞群，其中CD4+細(xì)胞為輔助性T淋巴細(xì)胞（TH細(xì)胞），CD8+細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（TC細(xì)胞），CD4+和CD8+及其比值是相對穩(wěn)定的，但是也受雞遺傳背景和性成熟程度等多種因素的影響，并受神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控[8]。在病理狀態(tài)下，病毒等感染后上述指標(biāo)更會(huì)發(fā)生顯著變化，其中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值作為重要的參考指標(biāo)，已經(jīng)在多種疾病的診斷方面被廣泛應(yīng)用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)組的CD4+與CD8+T細(xì)胞數(shù)量在感染后2周均明顯升高，但CD4+T細(xì)胞在之后較長時(shí)間（4～12周）表現(xiàn)為下降，尤其共感染組下降幅度最大。ALV-A單感染組在大部分時(shí)間引起的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯升高，12周時(shí)顯著高于其他各組，14周時(shí)顯著高于空白對照組和REV單感染組。第2～12周，與各感染組相比，共感染組引起CD4+/CD8+比值顯著低于對照組，這表明ALV-A和REV共感染導(dǎo)致的細(xì)胞免疫水平下降更加顯著。

模式識別受體TLRs是病原微生物激活天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵受體，目前已在雞的基因組中發(fā)現(xiàn)超過10種TLRs，對多個(gè)TLRs在雞組織及細(xì)胞中的表達(dá)已有系統(tǒng)研究報(bào)道[11]。多種TLRs在免疫抑制性病毒感染過程中的作用已有相關(guān)報(bào)道，施蕾等[12]發(fā)現(xiàn)chTLR3參與雞傳染性法氏囊病毒感染。有研究表明chTLR7可能參與了病毒感染早期的天然免疫反應(yīng)過程[13]。chTLR15是禽類特有的高度保守的TLRs[14]，感染腸炎沙門菌后TLR15的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且與TLR2的表達(dá)密切相關(guān)。本研究應(yīng)用熒光定量PCR檢測了多種TLRs的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明僅在感染后10周時(shí)ALV-A單感染組的chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相對轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于空白對照組，chTLR15相對轉(zhuǎn)錄水平顯著高于空白對照組，呈現(xiàn)出與腸炎沙門菌感染后類似的上調(diào)規(guī)律。

綜上所述，盡管在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)REV與ALV-A單感染及共感染引起部分細(xì)胞因子濃度呈現(xiàn)顯著變化，但變化幅度不大且規(guī)律不明顯，雞血清中各種細(xì)胞因子的濃度受REV與ALV-A感染影響小，相對穩(wěn)定。在感染2周后較長時(shí)間內(nèi)，不管是REV與ALV-A單感染還是共感染，其CD4+/CD8+比值均出現(xiàn)了不同程度的下降，共感染組下降尤其明顯，表明不同感染狀態(tài)對細(xì)胞免疫有抑制作用，其中共感染明顯加重對雞群的免疫抑制。本研究為加深對REV和ALV-A單感染或者共感染誘導(dǎo)雞群發(fā)生免疫抑制的理解提供了新的數(shù)據(jù)。