韋柳婷，胡振斌，高松林，韋湘紅，黃玲珊，吳凡

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；

2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

肝硬化腹水是肝硬化患者病程由代償期過渡至失代償期的標志，是門靜脈高壓、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)失衡和低蛋白血癥等多種因素綜合作用的結(jié)果[1]。腹水是肝硬化自然病程中的典型癥狀，每年會存在于5%～10%的代償期患者中[2]。代償期患者疾病進展過程中如果出現(xiàn)腹水，其5 年生存率將由原來的80%左右降為失代償期的30%左右，總體中位生存期僅約2 年[3]。西醫(yī)的治療方式主要有病因治療、限鈉、利尿、放腹水和補充白蛋白等[4]，但是可能會引起低鈉血癥、肝腎綜合征和肝性腦病等嚴重不良反應(yīng)[5-6]。

肝硬化腹水屬于中醫(yī)“鼓脹”范疇，其主要病機為三焦氣化不利、水液代謝失常[7]。五苓散源自《傷寒論》，由白術(shù)、澤瀉、豬苓、茯苓和桂枝組成。方中豬苓、澤瀉相配利水滲濕，使水濕之邪從小便而去；白術(shù)、茯苓健運中焦，培土以制水；桂枝溫陽化氣，助膀胱氣化功能，加強利水作用；全方共奏溫陽化氣利水之功，恰中其病機。此方有利尿、護腎、止瀉、控制血壓和調(diào)節(jié)代謝等效果[8]，同時具有改善肝功能的作用[9]。多篇文獻報道其對肝硬化腹水患者具有改善腹水癥狀、人血清白蛋白（ALB）水平和肝功能的療效，安全性較高，但相關(guān)的分子機制研究尚匱乏[10-13]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，探討五苓散治療肝硬化腹水的作用機制，為其后續(xù)深入研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 五苓散成分、靶點收集與整理

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）中以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 為條件檢索五苓散中所有中藥的活性成分并收集所對應(yīng)的靶點蛋白。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將靶點蛋白轉(zhuǎn)換為標準基因名。

1.2 肝硬化腹水靶點收集

以“Cirrhosis ascites”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMⅠM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數(shù)據(jù)庫中檢索疾病靶點。

1.3 交集靶點的篩選

應(yīng)用R語言獲取五苓散和疾病的交集靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以交集靶點為橋梁，反向篩選得到對應(yīng)活性成分和中藥，制作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表及屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，運用Network analyzer功能進行拓撲分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPⅠ）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

在STRⅠNG 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中導(dǎo)入交集靶點，限定物種為“Homo sapiens”，其他默認數(shù)值不做調(diào)整，構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡(luò)。運用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件對結(jié)果進行可視化分析。

1.6 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

使用R 語言程序和Bioconductor 數(shù)據(jù)庫（https://www.bioconductor.org/）中的“org.Hs.eg.db”人類數(shù)據(jù)庫，“clusterProfiler”“DOSE”“enrichplot”和“stringi”等軟件包對疾病和藥物的交集靶點以P=0.05、Q=0.05進行GO和KEGG功能富集分析。

1.7 分子對接

運用AutoDock Vina 1.1.2 將核心靶點與β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素和常春藤皂苷元（由于PubChem 數(shù)據(jù)庫未檢索到3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮，故不進行分子對接）進行分子對接。首先利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D 結(jié)構(gòu)文件，導(dǎo)入Chem3D軟件轉(zhuǎn)換為最小自由能的3D 空間構(gòu)象的.mol2 格式。在UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中將Status 設(shè)置為Reviewed，Popular organisms 設(shè)置為Human，結(jié)合是否存在小分子配體、構(gòu)象分辨率和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫文獻綜合分析，尋找核心靶點對應(yīng)蛋白的PDB ⅠD，通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載3D 晶體結(jié)構(gòu)。最后通過PyMOL 軟件和AutoDockTools 1.5.6 軟件對活性成分的3D 空間構(gòu)象和核心靶點對應(yīng)蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理，利用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接，并用PyMOL軟件展示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 五苓散活性化學(xué)成分和靶點篩選

通過TCMSP 得到五苓散50 個活性化學(xué)成分，其中茯苓、豬苓和澤瀉分別為15、11、10 個，白術(shù)和桂枝同為7 個，去重后共有46 個活性成分。桂枝和澤瀉中均含有谷甾醇；啤酒甾醇和麥角甾-7,22E-二烯-3β-醇是茯苓和豬苓的共同成分；過氧麥角甾醇是桂枝和豬苓的共同成分。46 個活性成分所對應(yīng)的61 個蛋白靶點，經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫校正后共得到47個靶點，涉及27個活性化學(xué)成分（表1）。

表1 五苓散潛在活性成分信息

續(xù)表1

2.2 肝硬化腹水相關(guān)靶點及交集靶點的篩選

收集GeneCards 數(shù)據(jù)庫（將score 設(shè)置為1）、OMⅠM、TTD 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫中的肝硬化腹水相關(guān)靶點，整合去重后共得到1623 個靶點基因。通過R 4.0.4 的VennDiagram 數(shù)據(jù)包得到17 個藥物-疾病交集靶點（圖1），反向推導(dǎo)得到23個活性成分。

圖1 五苓散治療肝硬化腹水的藥物-疾病共同作用靶點韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵活性成分分析

使用Cytoscape 3.8.0 軟件對17 個交集靶點進行藥物-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（圖2）。利用Cytoscape 3.8.0 軟件的“Network analyzer”功能，根據(jù)度值篩選排名前6 名的活性成分，分別是β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素、常春藤皂苷元、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮（表2）。

表2 五苓散治療肝硬化腹水度值前6位的活性成分

圖2 五苓散治療肝硬化腹水的藥物-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的篩選

運用STRⅠNG 數(shù)據(jù)庫對17 個交集靶點構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡(luò)（圖3），得到17個節(jié)點、55條邊，平均節(jié)點度值為6.47。通過Cytoscape 3.8.0 軟件分析中心性、介度中心性、特征向量中心性、緊密中心性、網(wǎng)絡(luò)中心性和基于局部平均連通性的方法拓撲參數(shù)，以6 個數(shù)值均大于其中位數(shù)的節(jié)點為條件進行篩選，得到胱天蛋白酶3（CASP3）、CASP8、熱休克蛋白90α（HSP90AA1）、環(huán)氧合酶2（PTGS2）和過氧化氫酶（CAT）、雌激素受體1（ESR1）等核心靶點（圖4）。

圖3 五苓散治療肝硬化腹水靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 五苓散治療肝硬化腹水PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點拓撲分析

2.5 GO功能富集分析

GO 分析得到800 個生物過程（BP）條目，30個細胞組成（CC）條目，73 個分子功能（MF）條目，GO 分析分別取前10 條進行展示（圖5）。在BP中主要涉及對類固醇激素的反應(yīng)和生殖結(jié)構(gòu)、生殖系統(tǒng)、女性性腺發(fā)育等方面；在CC中靶點富集在細胞器外膜、細胞外膜、膜筏、質(zhì)膜微區(qū)、膜區(qū)、線粒體外膜、核孔復(fù)合體和髓鞘等；在MF 中核受體活性和配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性富集程度最高。

圖5 五苓散治療肝硬化腹水的GO功能富集分析

2.6 KEGG富集分析

KEGG分析得到67條通路（P＜0.05，圖6），主要涉及晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、p53、白細胞介素-17（ⅠL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）和雌激素信號通路等。上述通路與五苓散干預(yù)肝硬化腹水的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

圖6 五苓散治療肝硬化腹水的KEGG通路分析（排名前30）

2.7 分子對接驗證

選取PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中核心靶點蛋白（HSP90AA1、CASP3、CASP8、PTGS2、ESR1、CAT）與β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素和常春藤皂苷元進行分子對接。結(jié)果顯示，化合物與靶點最低結(jié)合能為-10.5～-6.8 kcal·mol-1（1 cal≈4.184 J），均具有良好的結(jié)合力（表3）。其中花旗松素與CAT、表兒茶素與CAT、(+)-兒茶素與CAT、表兒茶素與PTGS2、β-谷甾醇與PTGS2、β-谷甾醇與HSP90AA1結(jié)合能分別為-10.5、-10.0、-9.2、-9.2、-9.2、-9.1 kcal·mol-1，結(jié)合能力最好，用PyMOL 可視化后見圖7。

圖7 五苓散治療肝硬化腹水部分活性成分與核心靶點分子對接

表3 五苓散治療肝硬化腹水活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果

3 討論

拓撲分析得出五苓散可能是通過β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素、常春藤皂苷元和3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮等活性成分治療肝硬化腹水。β-谷甾醇在富含脂質(zhì)的素食中含量豐富，具有抗菌抗炎、抗氧化、降血糖、調(diào)血脂和類激素功能等多種藥理作用[14]。β-谷甾醇能降低肝星狀細胞（HSC）中與細胞外基質(zhì)（ECM）合成相關(guān)的蛋白表達水平，減少膠原蛋白的積累量，發(fā)揮減輕活化人肝星狀細胞及二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的作用[15]。兒茶素及其立體異構(gòu)體可以通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf-2）、Toll 樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）和NF-κB 等多條信號通路發(fā)揮抗菌、抗炎、抗癌、護肝、控制血糖和增強記憶力等作用[16]。(+)-兒茶素能夠促進抗氧化酶中超氧化物歧化酶的表達，減少血清中血脂和丙二醛含量，從而修復(fù)小鼠的肝損傷和改善脂質(zhì)代謝[17]。表兒茶素可以通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)和減輕甲氨蝶呤肝毒性誘導(dǎo)的損傷起到護肝效果[18]?；ㄆ焖伤啬芡ㄟ^激活磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PⅠ3K/Akt）信號通路、抑制NF-κB 信號通路和提高抗氧化酶含量 [還原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）] 發(fā)揮抗凋亡、抗炎、抗氧化作用來逆轉(zhuǎn)小鼠肝損傷[19]。常春藤素皂苷元可以抑制促炎因子表達和阻斷p38 MAPK 活化達到抗炎、抗凋亡的效果，治療乙醇誘導(dǎo)的肝損傷[20]。蒼術(shù)酮可以抑制肝癌HepG2 細胞的遷移，并且能夠通過線粒體途徑促進其凋亡，其作用效果與劑量呈正相關(guān)[21]。

PPⅠ網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的關(guān)鍵靶點包含CASP3、HSP90 AA1、CASP8、PTGS2、ESR1 和CAT。CASP3 和CASP8 均屬 于凋亡Caspases 家族蛋白，CASP3 在細胞凋亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。CASP3 活化與肝星狀細胞（HSC）活化、膠原蛋白沉積和小鼠肝細胞損傷有關(guān)，能促進肝纖維化進程和肝細胞死亡[23]。CASP8 能夠減輕肝臟脂質(zhì)堆積和炎癥，在非酒精性脂肪肝炎（NASH）疾病進展中起負調(diào)控作用[24]。PTGS2 的表達產(chǎn)物環(huán)氧合酶2（COX-2）可以通過激活NF-κB 通路引起炎癥反應(yīng)和增加線粒體活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷肝臟[25]，其過度表達常與腫瘤密切相關(guān)[26]。塞來昔布（COX-2 抑制劑）可作用于脾肝軸，通過減少脾源性促炎性細胞因子表達和淋巴組織增殖，抑制氧化應(yīng)激刺激，對肝硬化有明確的治療效果[27]。HSP90AA1 是HSP90 基因家族中的1 種癌蛋白，能夠提高c-核蛋白類基因（c-MYC）的表達，促進肝細胞癌的產(chǎn)生和發(fā)展[28]，也是肝細胞癌的潛在診斷生物標志物，其表達的程度高低與肝細胞癌、胃癌等多種癌預(yù)后有緊密的聯(lián)系[29]。對酒精性肝病患者使用HSP90AA1 抑制劑能夠降低NLRP3 炎性體活性和下游促炎趨化因子（ⅠL-1β和ⅠL-18）的表達[30]。ESR1 是多種細胞色素P450酶（CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19）的調(diào)節(jié)劑，對肝臟的代謝過程有重要的影響作用[31]，其介導(dǎo)的環(huán)狀RNA-4018（circ_0004018）能夠抑制肝腫瘤細胞中血管的生成[32]。CAT 是一種抗氧化酶，能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制肝硬化的發(fā)展[33]。

對篩選出來的17 個交集靶點進行KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)五苓散主要通過AGE-RAGE、p53、ⅠL-17、TNF 和雌激素信號通路等治療肝硬化腹水。AGE與RAGE結(jié)合后能作用于MAPK、JAK2/STAT1等多條通路激活NF-κB 引起TGF-β、TNF-α和ⅠL-1等細胞因子的產(chǎn)生，促進肝星狀細胞活化、促纖維化因子形成和膠原蛋白合成及沉積，進而導(dǎo)致肝纖維化，逐步發(fā)展為肝硬化[34]。鐵死亡與肝纖維化相關(guān)，而p53 通路在細胞鐵死亡中具有關(guān)鍵作用[35]。p53 可以通過誘導(dǎo)鐵死亡抑制肝星狀細胞活化，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠的肝纖維化程度[36]。ⅠL-17 是Th17 的主要效應(yīng)分子，Th17/ⅠL-17 信號通路能夠引起持續(xù)炎癥反應(yīng)和纖維化，推動著乙型病毒性肝炎（HBV）和丙型病毒性肝炎（HCV）向肝硬化的方向發(fā)展[37]。Th17/ⅠL-17 軸既可以誘導(dǎo)HSC 活化、促纖維化因子表達和促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進膠原蛋白的合成和沉積，導(dǎo)致肝纖維化，又可以促進炎癥細胞的募集并增加促炎因子表達[38-42]。TNF-α是一種涉及細胞增殖、分化和凋亡，以及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多方面的多功能促炎性細胞因子[43]。由TNF-α形成的TNF-α誘導(dǎo)蛋白8 樣分子1（TⅠPE1）可以與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）直接結(jié)合，抑制TNF 受體相關(guān)因子6（TRAF6）的泛素化活性，產(chǎn)生預(yù)防肝脂肪變性、炎癥反應(yīng)和肝纖維化的作用[44]。雌激素信號通路在調(diào)節(jié)脂肪生成方面很重要，可以維持肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[45]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法從理論上初步論證了五苓散可以通過多成分、多靶點、多通路治療肝硬化腹水，主要起到抗炎、抗纖維化、抗氧化等多種作用。