徐友陽(yáng)，王德勤，李靜宇，梅瑜，王繼華，蔡時(shí)可*

（1廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程中心/廣東省農(nóng)作遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東廣州 510640；2廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州 510515）

顯齒蛇葡萄［Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang］是葡萄科蛇葡萄屬的藤本植物，為中藥材藤茶的基原植物，也稱茅巖莓、白茶、藤茶、甘露茶等，以地上部分入藥，莖葉可制茶，還可加工藤茶含片、藤茶飲料、藤茶果凍等產(chǎn)品[1，2]。其中，藤茶味甘淡、性涼，在我國(guó)已飲用700 余年，傳統(tǒng)記載有清熱解毒和消脹止渴等功效[3]。顯齒蛇葡萄的適應(yīng)性很強(qiáng)，多生長(zhǎng)在海拔400～1300 m 的山地，主要分布在廣東、廣西、湖北、湖南和貴州等地，重慶和江西部分地區(qū)也有少量野生資源[2]。顯齒蛇葡萄含有黃酮類、多酚類、鞣質(zhì)、氨基酸及微量元素等化合物，尤其二氫楊梅素（Dihy dromyricetin，DMY）的含量高，幼嫩莖葉中可達(dá)30%[4]，而水溶性多糖及水溶性蛋白含量相對(duì)較少[4，5]。其中，DMY 為多酚羥基雙氫黃酮醇，同屬于黃酮類和多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、控血脂和護(hù)肝等多種藥理活性。DMY 可通過(guò)抑制Parp 表達(dá)介導(dǎo)的線粒體凋亡，增強(qiáng)順鉑對(duì)A549 細(xì)胞的治療效果[6]。近年來(lái)，顯齒蛇葡萄的藥用功能獲得廣泛的關(guān)注，顯齒蛇葡萄提取物，以黃酮和二氫楊梅素為主的活性成分，是市場(chǎng)上深加工食品、保健品和藥品的常見(jiàn)原料[7]。

藥用植物次生代謝物質(zhì)的合成一直以來(lái)備受關(guān)注，從代謝相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)功能分子的代謝是研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于解析藥用植物中藥用成分合成代謝通路和調(diào)控機(jī)制[8]。但是大量的藥用植物基因組還未公布，基因組數(shù)據(jù)缺乏，限制深入挖掘功能物質(zhì)的代謝途徑，而轉(zhuǎn)錄組分析可以不依賴基因組數(shù)據(jù)，開(kāi)展功能基因的預(yù)測(cè)，開(kāi)展藥用植物的生物學(xué)過(guò)程及次生代謝的分子機(jī)制的研究[9]。顯齒蛇葡萄基因組學(xué)研究相對(duì)薄弱，僅查詢到其葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析的研究[10]。為此，本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)開(kāi)展顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄組特征研究，為解析其重要基因的挖掘和調(diào)控，以及分子標(biāo)記的開(kāi)放提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司清遠(yuǎn)基地栽培的顯齒蛇葡萄植株，于2021 年5 月份取樣，選取顯齒蛇葡萄植株的葉片和嫩莖作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品，取樣時(shí)剪下葉片和嫩莖后，迅速放入液氮中速凍，然后置于超低溫-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 顯齒蛇葡萄RNA 的提取

采用康為世紀(jì)的Total RNA Extractor 試劑盒分別進(jìn)行顯齒蛇葡萄葉片和嫩莖總RNA 提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，進(jìn)行建庫(kù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與拼接組裝

委托北京百邁客生物科技有限公司在其Illumina HiSeq2500 的高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)顯齒蛇葡萄葉片和莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。依據(jù)公司標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行組裝和拼接。

1.4 顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄組分析

組裝得到的顯齒蛇葡萄Unigenes 進(jìn)行注釋和結(jié)構(gòu)分析。分析流程參考本實(shí)驗(yàn)室之前過(guò)程[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝

顯齒蛇葡萄葉片和嫩莖的總RNA 經(jīng)過(guò)提取、cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序和原始測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾，去掉低質(zhì)量的序列，共獲到23，208，741 clean reads，總堿基數(shù)目為6，932，838，094 bp，GC含量為45.92%，Q30 bases ratio 達(dá)到94.26%。表明顯齒蛇葡萄的總RNA 經(jīng)過(guò)提取、cDNA 文庫(kù)和測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好。經(jīng)Denovo組裝，共得到109，934條轉(zhuǎn)錄本，總長(zhǎng)165，729，188bp，平均長(zhǎng)度為1507.53 bp，N50 為2195 bp，序列長(zhǎng)度在1000～2000 bp 的有31，321 條，占總序列數(shù)目的28.49%，序列長(zhǎng)度在2000 bp 以上的有29，434 條，占總數(shù)的26.77%（表1、圖1）。對(duì)Trinity 拼裝后得到的轉(zhuǎn)錄本，去除冗余序列后，共獲得43，603 條Unigene，總長(zhǎng)43，611，776 bp，平均長(zhǎng)度為1000.20 bp，N50 為1，580 bp，其中25，147 條序列長(zhǎng)度大于500 bp，占總序列數(shù)目的57.67%，序列長(zhǎng)度在1000 bp 以上的有13，736 條，占總數(shù)的31.50%（表1 和圖1）。

圖1 顯齒蛇葡萄Unigene 序列長(zhǎng)度分布

表1 顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果

2.2 Unigene 功能注釋

顯齒蛇葡萄組裝后的Unigenes 序列與NR、NT、CDD、KOG、COG、PFAM、Swissprot、TrEMBL 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共有 25714（58.97%）條Unigene 在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相應(yīng)的注釋（表2）。其中在Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的Unigene 數(shù)目最多（25，081 條），占總Unigene 的57.52%，其次為T(mén)rEMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋到的unigene 為24 925 條，占比為57.16%。COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的Unigene 數(shù)目最少（6283 條，14.41%）。通過(guò)與Nr 庫(kù)的比對(duì)分析，獲得顯齒蛇葡萄在轉(zhuǎn)錄組水平上的近緣物種，結(jié)果顯示與Vitis vinifera、Vitis riparia和Rhodamnia argentea的序列先比較，其分別有62.72%、27.44%和0.72%序列可以匹配?？梢?jiàn)顯齒蛇葡萄與葡萄的序列相似度最高（圖2）。

表2 Unigene 的功能注釋

圖2 NR 數(shù)據(jù)庫(kù)的同源物種分類

2.3 KEGG 功能注釋

根據(jù)顯齒蛇葡萄Unigene 在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋分析，共有15，934 個(gè)Unigene 分布在五大類功能，分別是代謝（3793，20.11%）、遺傳信息過(guò)程（2620，14.67%）、環(huán)境信息過(guò)程（944，3.53%）、有機(jī)系統(tǒng)（841，2.69%）和細(xì)胞過(guò)程（496，2.83%）。根據(jù)Unigene 在代謝過(guò)程的作用，可再細(xì)分為18類，共涉及133 個(gè)代謝通路（圖3）。其中，與次生代謝372 個(gè)（1.55%）、氨基酸代謝621 個(gè)（3.37%）和脂質(zhì)代謝621 個(gè)（3.33%）相關(guān)的Unigene 相對(duì)較多。代謝過(guò)程為翻譯（1029，5.96%）的Unigene 在遺傳信息過(guò)程中注釋到最多，而與內(nèi)吞作用的Unigene（283，2.83%）在細(xì)胞過(guò)程中最多。801條顯齒蛇葡萄的Unigene 涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可為其生物過(guò)程中信號(hào)因子及其響應(yīng)環(huán)境刺激提供研究基礎(chǔ)。顯齒蛇葡萄主要含苯丙烷類、類黃酮類、黃酮和黃酮醇、異喹啉生物堿等化學(xué)成分，其中類黃酮類化合物非常豐富。本研究鑒定到187 個(gè)Unigene 涉及苯丙烷類生物合成，75 個(gè)Unigene 涉及類黃酮類物質(zhì)的生物合成，其中4 個(gè)Unigene 涉及黃酮和黃酮醇類化合物生物合成，48 個(gè)Unigene 與異喹啉生物堿生物合成相關(guān)，7 個(gè)Unigene 參與花青素生物合成，29 個(gè)Unigene 涉及二苯乙烯類、姜辣素和二芳基庚烷類生物合成；46 個(gè)Unigene 涉及托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成（圖4）。顯齒蛇葡萄富含次生代謝物基因，Unigene 的分析為進(jìn)一步解析其藥用成分的代謝提供了基礎(chǔ)。

圖3 顯齒蛇葡萄Unigene 的KEGG 功能分類

圖4 其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成代謝途徑分析

2.4 GO 功能注釋

共有20，522 條顯齒蛇葡萄Unigene 在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)的生物過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）及分子功能（Molecular funtion）三大類中得到注釋（圖5）。其Unigene 可繼續(xù)劃分為43 個(gè)功能分類，包括代謝過(guò)程、刺激響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等。其中，細(xì)胞組分中的結(jié)合注釋到的Unigene 最多，共有13，040 個(gè)，占47.07%；生物過(guò)程中的細(xì)胞過(guò)程注釋到的Unigene也較多，為11，314 條。與藥用成分相關(guān)的代謝過(guò)程（9922），催化活性（8976），抗氧化活性（122），這些通路與顯齒蛇葡萄藥用成分的代謝密切相關(guān)。

圖5 顯齒蛇葡萄Unigene 的GO 功能分類

2.5 黃酮類生物合成基因的鑒定

黃酮類物質(zhì)是顯齒蛇葡萄的主要活性成分，其中DMY 含量較高，其為多酚羥基雙氫黃酮醇，也屬于多酚類化合物，具有多種藥理活性。根據(jù)顯齒蛇葡萄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其黃酮類生物合成代謝途徑。肉桂酰CoA 和對(duì)香豆酰CoA 在黃酮類化合物合成通路中作為起始底物。在苯丙酸生物合成通路中，苯丙氨酸由重要酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸-CoA 連接酶（4CL）和肉桂酸4-羥化酶（CYP73A/C4H）催化合成。在黃酮類化合物的生物通路中，對(duì)香豆酰CoA 和丙二酰CoA 在查爾酮合酶（CHS）的催化下產(chǎn)生柚皮素查爾酮或異甘草素，然后在查爾酮異構(gòu)酶（CHI），也是黃酮代謝途徑上游的關(guān)鍵酶的作用下，異構(gòu)化得到柚皮素或甘草素。甘草素還是異黃酮生物合成的主要底物，柚皮素可參與多種代謝途徑[12]。顯齒蛇葡萄中黃酮類生物合成中還有鑒定到黃烷酮3-羥化酶（F3H），黃酮醇合成酶（FLS）等Unigenes，共同催化產(chǎn)生一系列的具有藥用功能的次生代謝產(chǎn)物。在顯齒蛇葡萄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到75 個(gè)黃酮類生物合成通路中的關(guān)鍵基因，包括16 個(gè)編碼4CL，10 個(gè)編碼CHS 和7 個(gè)編碼PAL 的Unigenes（表3）。

表3 黃酮類生物合成相關(guān)的主要候選基因

2.6 轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在，調(diào)具有調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程中的基因表達(dá)，常以基因家族形式存在，如MYB、bHLH、WRKY 和NAC 等。不同的基因家族與不同功能密切相關(guān)，TFs 的調(diào)控作用機(jī)制是植物功能基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。根據(jù)顯齒蛇葡萄Unigene 和TF 數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比，共鑒定出2062 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中屬于AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子類的Unigene 數(shù)目最多，達(dá)到了（74 個(gè)），其次是C2H2、bHLH、RLK-Pelle-DLSV、MYB-related、MYB、WRKY等（圖6）。顯齒蛇葡萄中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境響應(yīng)和次生代謝等生物學(xué)過(guò)程，為進(jìn)一步研究其藥用功能物質(zhì)的的生物合成和調(diào)控提供基礎(chǔ)。

圖6 顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄因子分類

2.7 SSR 分析

采用MISA 對(duì)組裝長(zhǎng)度為1,000bp 以上的13,736 條unigene 進(jìn)行SSR 檢測(cè)，并對(duì)SSR 的類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，在3876 條unigene 中共鑒定到4771 個(gè)SSR 位點(diǎn)。其中，895 條unigene 中檢測(cè)到2 個(gè)上的SSR 位點(diǎn)。最豐富的重復(fù)類型是單堿基重復(fù)，共檢測(cè)到2314 個(gè)位點(diǎn)，其次為雙堿基重復(fù)1168 個(gè)、三堿基重復(fù)916 個(gè)、四堿基重復(fù)60個(gè)、六堿基重復(fù)7 個(gè)，最少的為五堿基重復(fù)，僅檢測(cè)到6 個(gè)位點(diǎn)（圖7）?；?771 個(gè)SSR 位點(diǎn)，使用Primer 3.0 設(shè)計(jì)引物，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)顯齒蛇葡萄的遺傳標(biāo)記和近緣種屬的遺傳圖譜提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖7 顯齒蛇葡萄Unigene 的SSR 位點(diǎn)和數(shù)目分布

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)中藥材的質(zhì)量備受關(guān)注，真?zhèn)舞b定一直以來(lái)是中藥材產(chǎn)業(yè)的難點(diǎn)[13]。一方面中藥材種植規(guī)模較小，來(lái)源廣泛，加之部分品種基源植物不清，嚴(yán)重影響中藥材的質(zhì)量的可靠性和穩(wěn)定性。利用分子生藥學(xué)技術(shù)，開(kāi)展中藥材的真?zhèn)舞b定意義重大[14]。本研究利用二代高通量測(cè)序?qū)︼@齒蛇葡萄的葉片和嫩莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，共獲得的高質(zhì)量Clean Data 6.3G，測(cè)序數(shù)量大，質(zhì)量和數(shù)量均滿足轉(zhuǎn)錄組分析。組裝獲得顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄組含有43，603 個(gè)Unigene，N50 長(zhǎng)度為1，580 bp，平均長(zhǎng)度1000.2bp，其中25，714 個(gè)（58.97%）Unigene在KOG、GO、KEGG、NR 和SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，與Vitis vinifera的親緣關(guān)系最為接近。在顯齒蛇葡萄中我們共鑒定到75 個(gè)Unigene 涉及黃酮類生物合成、4 個(gè)Unigene 參與黃酮和黃酮醇生物合成，13 個(gè)Unigene 參與異黃酮生物合成。黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)基因數(shù)量較多，這也與其該類化合物的含量較多的結(jié)果一致。在黃酮類要用在植物中，龍俐葉含量較多的異黃酮，其相應(yīng)的Unigene也比黃酮相關(guān)的多[12]。表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可用于顯齒蛇葡萄次生代謝物質(zhì)的合成途徑和重要功能基因的挖掘，調(diào)控機(jī)制的研究[10]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)具有分析速度快、成本低，逐漸應(yīng)用在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[8]。在顯齒蛇葡萄的1000 bp 以上的Unigene 分析發(fā)現(xiàn)，4771 個(gè)Unigene 包含5 869 個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列，并使用Primer 3.0 設(shè)計(jì)引物，可用于其物種進(jìn)化分析和真?zhèn)蔚蔫b定。顯齒蛇葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得了其轉(zhuǎn)錄組信息特征，為開(kāi)展重要功能基因鑒定，次生代謝通的挖掘和更好的利用奠定了研究基礎(chǔ)。