何家穎 劉明嶺 李淑瑤 王馨玉 關(guān) 彤

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，廣東廣州 510405

痛風(fēng)是一種尿酸鹽沉積所致的關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關(guān)。目前我國(guó)的痛風(fēng)患病率為1%～3%，呈逐年上升、年輕化的趨勢(shì)[1]。痛風(fēng)易反復(fù)發(fā)作，長(zhǎng)期服藥可導(dǎo)致肝、腎功能損害，而且在降尿酸的初始階段還可能誘導(dǎo)痛風(fēng)急性發(fā)作[2]。桂枝芍藥知母湯具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、滋陰清熱的功效，可治療痛風(fēng)的外因（風(fēng)寒濕邪侵襲）和內(nèi)因（肝腎虛損，營(yíng)衛(wèi)不和）。藥理研究表明桂枝芍藥知母湯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)腎功能和促進(jìn)尿酸排泄的作用[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多維度視角理解疾病的分子基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)機(jī)制[4]，揭示了中醫(yī)藥的科學(xué)性和有效性。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從成分、靶點(diǎn)、通路等多方面共同探討桂枝芍藥知母湯治療痛風(fēng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 收集桂枝芍藥知母湯的活性成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和痛風(fēng)靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)中分別以“桂枝、白芍、知母、甘草、麻黃、生姜、白術(shù)、防風(fēng)、附子”為檢索詞，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為篩選條件檢索活性成分，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充活性成分。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。以“gout”為檢索詞分別檢索OMIM、GeneCards、DisGeNET 和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，收集合并痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建疾病-藥物-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 軟件中的Merge 插件將藥物與疾病靶點(diǎn)取交集，并構(gòu)建疾病-藥物-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置物種為人類，將共同靶點(diǎn)分別輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖和繪制PPI 富集分析圖。

1.3 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

設(shè)定閾值為P ＜0.05，應(yīng)用R 軟件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，并繪制條形圖。

2 結(jié)果

2.1 桂枝芍藥知母湯活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)、共同靶點(diǎn)

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得桂枝芍藥知母湯活性成分119 個(gè)，從文獻(xiàn)補(bǔ)充活性成分6 個(gè)，總活性成分125 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)218 個(gè)，疾病靶點(diǎn)903 個(gè)，共同靶點(diǎn)60 個(gè)。

2.2 疾病-藥物-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)

疾病-藥物-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)見圖1，該網(wǎng)絡(luò)包含180 個(gè)節(jié)點(diǎn)，458 條邊，節(jié)點(diǎn)顏色越深，度值越高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，度值前8 的核心成分見表1，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素和β-谷甾醇既是核心成分又是共同成分。

表1 核心成分

圖1 疾病-藥物-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)和PPI 富集分析

PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖2，該網(wǎng)絡(luò)包含58 個(gè)節(jié)點(diǎn)，595 條邊，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，度值越高。核心靶點(diǎn)包括IL-6、TNF、GAPDH、VEGFA、TP53、PTGS2、IL-1B、TLR4 和JUN（原癌基因）。PPI 富集分析見圖3，形狀相同的靶點(diǎn)共同參與某種生物過程或分子功能或細(xì)胞組分。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用富集分析圖

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析獲得條目95 個(gè)，KEGG 通路富集分析獲得通路130 條，按P 值從小到大排列，排名前20的GO 條目和通路繪制成條形圖，見圖4～5。GO 功能富集分析主要涉及磷酸酶結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、MAPK活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、氧化還原酶活性等分子功能，KEGG 通路富集分析共獲得7 條與痛風(fēng)密切相關(guān)的信號(hào)通路，分別是TNF 信號(hào)通路、TLR 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、CLR 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路，同時(shí)還獲得流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等信號(hào)通路。

圖4 GO 分析圖

3 討論

痛風(fēng)急性期的特征之一是發(fā)病部位存在中性粒細(xì)胞募集[5]，典型表現(xiàn)是關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛。β-谷甾醇可抑制中性粒細(xì)胞遷移以減輕炎癥[6]，其他核心成分也都具有抗炎作用。槲皮素、山柰酚、柚皮素、木犀草素、升麻素和肉桂醛具有鎮(zhèn)痛作用，6-姜酚、升麻素和肉桂醛具有解熱作用[7-13]。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，木犀草素和山柰酚作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，其能阻斷次黃嘌呤、黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)多與炎癥相關(guān)，其中TP53的功能獲得性突變?cè)谘装Y中起關(guān)鍵作用[15]。IL-1β 和IL-6 皆為痛風(fēng)重要的炎癥介質(zhì)，IL-1β 是調(diào)節(jié)炎癥的起始因子，TNF-α 通過調(diào)節(jié)pro-IL-1β mRNA 的表達(dá)可增加IL-1β 的分泌[16]。IL-6 可擴(kuò)大炎癥，且與關(guān)節(jié)畸形、骨破壞、痛風(fēng)石有關(guān)[17]。GAPDH 是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6 等促炎因子所必需的[18]，PTGS2 在促炎因子的刺激下產(chǎn)生前列腺素參與炎癥。VEGF 與炎癥呈正相關(guān)，VEGFA 能增加血管通透性，從而刺激炎癥形成和發(fā)展[19]。

PPI 富集分析發(fā)現(xiàn)桂枝芍藥知母湯不僅作用于炎癥，還作用于痛風(fēng)石的生長(zhǎng)、尿酸代謝等。圖3A 主要與轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，NF-κB 是痛風(fēng)最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，其能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，還能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的表達(dá)。圖3B 主要與肽酶活性、細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)，其與MMP1、MMP2、MMP9 聯(lián)系最緊密。研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)石中的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生MMP2 和MMP9，MMP的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)[20]，痛風(fēng)石外層的肉芽腫會(huì)隨細(xì)胞外基質(zhì)的降解而生長(zhǎng)，同時(shí)巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，這可能會(huì)限制巨噬細(xì)胞的破壞潛力[21]。圖3C主要與血脂代謝有關(guān)，血脂與尿酸呈正相關(guān)[22-24]，桂枝芍藥知母湯通過調(diào)節(jié)APOB、LDLR 和PON1 可降低尿酸和血脂水平。

GO 富集分析發(fā)現(xiàn)磷酸酶結(jié)合和MAPK 活性參與痛風(fēng)骨破壞、細(xì)胞代謝和炎癥過程。痛風(fēng)患者的骨吸收表面、關(guān)節(jié)液及痛風(fēng)石內(nèi)存在大量的酸性磷酸酶，此酶與破骨細(xì)胞的活性呈正相關(guān)，可增強(qiáng)骨吸收，促進(jìn)骨破壞。受尿酸單鈉晶體刺激時(shí)MAPK 被激活，其參與細(xì)胞凋亡的延遲和NETosis[25]。NETosis 是中性粒細(xì)胞特殊的死亡方式，發(fā)生過程中會(huì)形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)[26]，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)可產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)交聯(lián)體，其含有的中性粒細(xì)胞蛋白酶可降解促炎因子，限制炎癥反應(yīng)[5]。

圖5 KEGG 通路富集分析圖

KEGG 通路富集分析共獲得7 條與痛風(fēng)密切相關(guān)的信號(hào)通路。其中AGE-RAGE、TNF 和TLR 的信號(hào)傳導(dǎo)均受下游NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路的控制。AGE-RAGE 信號(hào)傳導(dǎo)通過激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多條信號(hào)通路，從而激活NF-κB，參與炎癥反應(yīng)?？扇苄訲NF 通過TNFR1 傳遞的信號(hào)通路主要激活促炎通路[27]，包括NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，最終導(dǎo)致白細(xì)胞激活和募集、促炎因子產(chǎn)生、炎癥介質(zhì)合成等。TLR 信號(hào)傳導(dǎo)途徑：①M(fèi)yD88 依賴性途徑：尿酸單鈉晶體與TLR 結(jié)合后可活化MyD88，繼而激活下游NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路產(chǎn)生促炎因子，快速激活固有免疫。②MyD88 非依賴性途徑：TLR激活T 細(xì)胞并介導(dǎo)其趨化，從而激活適應(yīng)性免疫。CLR 也能激活固有免疫和適應(yīng)性免疫，同時(shí)還參與了多種關(guān)節(jié)病[28]。CLR 通過激活NLRP3炎癥小體，產(chǎn)生IL-1β，其與IL-6、TNF 等細(xì)胞因子共同促進(jìn)Th1 和Th17 細(xì)胞分化，參與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)。Th17 細(xì)胞的系統(tǒng)分化、成熟和局部募集及其產(chǎn)物IL-17 是痛風(fēng)引起靶組織損傷的潛在機(jī)制之一。IL-17 抗體可調(diào)節(jié)尿酸單鈉晶體引起的痛風(fēng)性炎癥，減輕關(guān)節(jié)癥狀和白細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)[29]。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)：①桂枝芍藥知母湯在治療痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)、尿酸代謝紊亂、骨破壞等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮顯著作用。②NF-κB和MAPK 信號(hào)通路是痛風(fēng)發(fā)病的核心，阻斷他們是痛風(fēng)治療的關(guān)鍵。③巨噬細(xì)胞的凋亡和中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的產(chǎn)生都與痛風(fēng)自限性有關(guān)，另外IL-17 抗體可減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)癥狀和白細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)，這些都為痛風(fēng)的治療提供了新思路。④桂枝芍藥知母湯通過調(diào)節(jié)APOB、LDLR 和PON1 靶點(diǎn)，NF-κB和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路有助于治療高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等痛風(fēng)常見的合并癥。本研究具有一定的局限性，一是著重探討痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)，對(duì)尿酸代謝、骨破壞等方面的研究尚未深入；二是本研究的結(jié)論有待今后的臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。